長鏈非編碼RNA BCYRN1對肺腺癌細胞生物學行為的影響

李世雄，耿華，徐美林△

肺癌是呼吸系統最常見的惡性腫瘤之一。近年來由肺癌造成的死亡人數高于乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和腦腫瘤死亡人數的總和［1］。由于不同地區醫療水平差異和患者的臨床病理分期不同，肺癌的5年生存率為4%~17%［2］。肺腺癌是最為常見的一種肺癌亞型，其發生發展的機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是長度超過200個核苷酸，但不編碼蛋白質的核酸序列。研究表明，lncRNA的紊亂與人類多種疾病密切相關，其中包括多種癌癥［3］。LncRNA腦胞質RNA1（brain cytoplasmic RNA 1，BCYRN1）在食管癌［4］、乳腺癌、結直腸癌［5］和肝癌［6］等腫瘤中高表達。目前關于lncRNA BCYRN1在肺腺癌中作用機制的相關研究鮮見報道。本研究通過多種分子實驗技術探究BCYRN1對肺腺癌生物學惡性行為的影響，并結合肺腺癌數據庫探究BCYRN1表達與患者臨床病理特征以及預后的相關性，旨在探究BCYRN1在肺腺癌細胞中的表達情況及其對腫瘤細胞生物學行為的影響。

比較 PAC吸附和 Fenton試劑降解對 HHCB與AHTN的去除效果可以發現，在適宜的條件下，Fenton試劑比PAC吸附對HHCB與AHTN的去除效果更好，但Fenton試劑反應受pH值的影響更大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 正常肺上皮細胞BEAS-2B購于上海吉凱基因化學技術公司，293T細胞及肺腺癌細胞系A549、H1299由天津醫科大學病理學教研室孫保存課題組贈予。

海德堡對印刷未來圖景的描繪讓我們充滿遐想，忍不住追問，在中國何時能實現自主印刷？黃連光坦率表示，自主印刷在國內只是剛開始，但是相信一定會迎來跳躍式的發展。“我們常常會錯誤估計中國的發展速度，其實往往在其他國家需要花十幾二十年時間才能實現的事情，在國內則會很短。當然，這也是必然的發展方向。”

侵襲實驗：步驟大致同前，不同點是實驗前4 h需要在Transwell小室內鋪一層稀釋比為1︰7的martigel膠，在培養箱內水化。48 h后再固定染色。

1.1.3 實驗設備及儀器 10 cm培養皿、6孔板、12孔板、24孔板（Invitrogen），離心機（德國Eppendorf），搖床（德國Eppendorf，RT430），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司，BSC-600IIA2），微量移液器和槍頭（Thermo ScientificTMClipTipTM），純水機（法國Millipore，明澈-D 24 UV），紫外分光光度計（美國Molecular Devices，UPG-723），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystem，ABI7500型），Transwell小室（康寧公司），普通光學顯微鏡（日本Nikon，Ts2/Ts2-FB），熒光顯微鏡（日 本Nikon，Ts2/Ts2-FL），流 式 細 胞 儀（美 國BD，FACSCalibur）。

1.2 方法

2.2 轉染效率的檢測 與對照組相比，慢病毒感染后BCYRN1敲低組的BCYRN1表達水平明顯下降，見圖2。

1.2.2.5 職業技能訓練:每周1次，每次 60 min。通過求職面試技能訓練、開放模擬超市、蛋糕烘焙制作、包餛飩、做壽司、手工制作和環境保潔等勞動技能訓練和外出社會實踐活動等方式，提高患者的勞動技能，改變患者的觀念，鼓勵患者做力所能及的事。

1.2.2 qPCR檢測BCYRN1在不同類型肺癌細胞系中表達 在細胞生長融合度達到80%時消化細胞，離心收集細胞沉淀。采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測各個樣本的濃度和純度。隨后通過反轉錄得到cDNA，按照qPCR使用說明書進行擴增和熒光定量檢測。反轉錄條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。qPCR反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40個循環。每個樣本重復3次，最后所得到的數據經過2-??Ct法分析處理。BCYRN1引物：上游5'-CTGGGCAATATAGCGAGAC-3'，下 游5'-TGCTTT?GAGGGAAGTTACG-3'；GAPDH引物：上游5'-GGAGCGA?GATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCT?CATGG-3'。

直流側不平衡故障相當有將系統的零電位從換流器上下橋臂中點移向故障點，從而引起交直流電壓的偏置。交流側變壓器由于流過直流電流而發生直流偏磁，影響變壓器的安全運行；直流電壓偏置將對設備的絕緣造成影響，但配網設備的絕緣水平相對容易提高。

2.4 BCYRN1敲低對細胞遷移和侵襲能力的影響 實驗12 h和24 h后，BCYRN1敲低組劃痕愈合率均較對照組降低，見圖4。Transwell遷移實驗也顯示BCYRN1敲低組H1299細胞穿過小室的細胞顯著減少，見圖5。

1.2.5 細胞劃痕實驗觀察細胞遷移能力 胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，計數相同的細胞數，接種于6孔板培養。當細胞融合度達到95%時，用槍頭在6孔板內均勻劃線，PBS沖掉劃下的細胞，加入含2%血清的低濃度培養基。根據細胞生長速度分別于0、12、24 h拍照記錄至任意一組劃痕愈合。

1.2.6 Transwell實驗檢測轉染后細胞遷移及侵襲能力 遷移實驗：胰酶消化細胞，離心后加入1 mL無血清培養基制成細胞懸液，經PBS稀釋后使細胞含量為1×105個/mL。24孔板加入600μL完全培養基，吸取200μL細胞懸液至Transwell小室，繼續培養。24 h后，取出小室，用PBS小心沖洗，棉簽擦拭掉未穿過的細胞。用預冷過的甲醇固定細胞，PBS沖洗，再用0.4%結晶紫染色1 h，PBS沖洗。選取不同的視野拍照記錄。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、1640培養基（凱基生物科技公司），胎牛血清（Gibco公司），胰酶、嘌呤霉素（Sigma公司），PBS緩沖液（中杉金橋生物技術有限公司），RNA提取試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒（天根生化公司），RNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測試劑盒（寶日醫生物技術公司），引物、慢病毒包裝試劑盒（吉凱基因化學技術公司），BCYRN1敲低和對照質粒、轉染試劑lipfit3.0（漢恒生物科技公司），碘化丙啶染色液、結晶紫染色液（碧云天生物技術有限公司），聚凝胺Polybrene（索萊寶科技有限公司），基質膠Matrigel（美國Becton&Dickinson公司）。

2.3 BCYRN1對肺癌細胞周期和凋亡的影響 G1/G0峰到G2/M峰之間為細胞周期S期，G1/G0峰之前有小段的凋亡峰，見圖3。BCYRN1敲低組的S期細胞百分比和細胞凋亡率均高于對照組，見表1。

1.3 統計學分析 采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示，2組樣本間數據比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，χ2檢驗分析BCYRN1表達與臨床病理特征的關系，Cox回歸分析BCYRN1表達與患者預后的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BCYRN1在肺腺癌細胞A549、H1299中的表達 與正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，LncRNA BCYRN1在肺腺癌細胞內高表達（P＜0.05）。BCYRN1在A549細胞的表達水平約為BEAS-2B細胞的3倍，BCYRN1在H1299細胞的表達水平約為BEAS-2B細胞的11倍，見圖1。因此選用H1299細胞進行后續細胞功能實驗。

1.2.3 質粒轉染以及慢病毒感染目的細胞 計數相同數量的H1299細胞，分為實驗組和對照組，分別轉染BCYRN1敲低及對照質粒。轉染前2 h將293T細胞培養基更換為Opti-MEM培養基，取慢病毒載體質粒、Lenti-Easy Packaging Mix和Opti-MEM混合為A液；Lipfit 3.0和Opti-MEM混合為B液，兩者混合形成轉染復合物。轉染體系加入293T培養液中，8 h后換為正常DMEM培養基。48~72 h收集細胞上清，離心、過濾、純化收集病毒液。感染目的細胞時，目的細胞換為融合度為50%~60%的6孔板，每孔加入2 mL含有熱滅活血清的DMEM培養基，培養過夜，第2天換液加入慢病毒液、完全培養基、Polybrene，晃動混勻后培養12 h，隨后換為正常培養基。轉染效率通過質粒內的綠色熒光檢測，經嘌呤霉素篩選后獲得穩定轉染的目的細胞株。

Fig.1 Expression levels of BCYRN1 in lung cancer cells and normal lung epithelium cells圖1 BCYRN1在肺腺癌細胞及正常肺上皮中的表達水平

1.2.1 細胞培養 肺腺癌細胞A549、H1299和正常肺上皮細胞BEAS-2B用相適應的培養基加入10%胎牛血清，在37℃、含5%CO2的細胞培養箱內培養。根據細胞生長密度適時進行細胞傳代和凍存。使用細胞計數板，按照計上、不計下，計左、不計右的原則計算細胞數目。

Fig.2 H1299 cells transfected with green fluorescently labeled plasmid venom(×100)圖2 綠色熒光標記病毒液轉染后的H1299細胞（×100）

1.2.7 LncRNA BCYRN1的生物信息學分析 肺腺癌患者的RNA-seq數據和臨床病理特征數據從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫下載，共包括585個腫瘤樣本，所有RNA-seq數據進行log2（x+1）變換。根據BCYRN1的表達水平，將BCYRN1表達高于平均值的患者定義為高表達組，低于或等于平均值患者定義為低表達組。再根據年齡、性別、腫瘤分期、TNM分期對患者進行分層。分析BCYRN1表達水平與患者臨床病理特征的關系。從lnCAR網站（http://lncar.renlab.org/）獲取BCYRN1在肺腺癌中的表達數據，通過Cox回歸分析BCYRN1表達與患者預后的關系。

1.2.4 流式細胞儀檢測BCYRN1對細胞周期和凋亡的影響 收集貼壁細胞，1 mL預冷的PBS重懸細胞，離心沉淀細胞后，用70%的預冷乙醇混勻固定細胞12~24 h。再次用PBS重懸細胞，離心沉淀細胞后，每個樣本加入0.5 mL的碘化丙啶染色液，37℃避光溫育30 min，隨后完成流式細胞檢測。

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Fig.3 Cell cycle and apoptosis detected by flow cytometry圖3 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

Tab.1 Changes of cell cycle and apoptosis in control group and BCYRN1 down-regulated group表1 對照組和BCYRN1敲低組細胞周期和凋亡變化（n=3，%，x±s）

Fig.4 Scratch healing rates in BCYRN1 knockdown group and control group圖4 對照組和BCYRN1敲低組的劃痕愈合率

Fig.5 Results of Transwell migration and invasion experiments(Crystal violet staining,×100)圖5 Transwell遷移侵襲實驗結果（結晶紫染色，×100）

2.5 BCYRN1表達與肺腺癌患者臨床病理特征及預后的關系 使用TCGA數據將肺腺癌患者分為BCYRN1高表達組與低表達組，通過χ2檢驗得到BCYRN1表達水平與肺腺癌患者腫瘤分期和N分期有關（P＜0.05），但與年齡、性別以及其他臨床病理特征無關（P＞0.05），見表2。Cox回歸分析結果顯示，與BCYRN1低表達組患者相比，BCYRN1高表達組患者的生存時間顯著降低（P＜0.05），BCYRN1高表達的肺腺癌患者的預后較差，見圖6。

（1）測量標準：對于平面式電加熱板型的表面溫源采用表面溫度計測量，表面溫度計校準結果擴展不確定度應符合U=2.0℃ k=2。對于干井式或有校準孔型的表面溫源采用柔性T型熱電偶溫度傳感器測量，柔性T型熱電偶溫度傳感器連電測儀表整體檢測應符合≤0.3℃。

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3 討論

肺腺癌是肺癌最常見的病理亞型，是發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。LncRNA BCYRN1又名BC200、LINC00004，位于染色體2p21，是由RNA聚合酶Ⅲ轉錄的長度為200個核苷酸的非編碼RNA。序列分析顯示BCYRN1由3段不同序列的結構域組成，包括一個5'端的Alu片段、一段富含腺嘌呤的結構和一個富含胞嘧啶的區域［7］。筆者試圖探究BCYRN1對肺腺癌細胞生物學行為的影響。

3.1 BCYRN1在多種腫瘤中的生物學功能 Gu等［5］研究表明，與癌旁對照組織相比，結腸癌腫瘤組織中BCYRN1表達明顯上調，并且BCYRN1的過表達與腫瘤體積增大和晚期病理階段相關。另有研究顯示，BCYRN1的高表達與高度核分裂象相關，而核分裂是癌細胞侵襲行為的指標，提示其作為一種預后指標可評估早期乳腺腫瘤的侵襲能力［8］。Ming等［9］發現，將患者血漿內的BCYRN1和甲胎蛋白表達水平相結合可顯著提高肝癌的診斷效能。周亞楠等［10］關于BCYRN1與食管鱗癌關系的研究表明，BCYRN1在食管癌中高表達，抑制其表達后，食管癌細胞的侵襲、遷移能力降低。上述研究揭示了BCYRN1作為一種促癌基因的潛能。

Tab.2 Relationship between expression level of BCYRN1 and clinicopathological characteristics of lung adenocarcinoma patients表2 BCYRN1表達水平與肺腺癌患者臨床病理特征間的關系

Fig.6 Survival curves of high and low expression groups of BCYRN1 in patients with lung adenocarcinoma圖6 肺腺癌患者BCYRN1高、低表達組生存曲線

3.2 BCYRN1的潛在分子作用機制 LncRNA的生物學作用主要表現為順式或反式轉錄因子的調控、mRNA的加工、轉錄后的調節和蛋白激活等功能［11］。此外，lncRNA已被發現在表觀遺傳以及基因表達調控中發揮重要作用［12］。LncRNA在腫瘤發生發展的多個病理過程中也發揮著積極的作用，參與多種分子通路的調控，可作為非小細胞肺癌（NSCLC）潛在的治療靶點［13］。有研究顯示lncRNA對肺癌有較好的診斷效能，轉移相關肺腺癌轉錄本1（MALAT1）被視為診斷NSCLC的血液生物學標志物［14］。另一項研究表明，NSCLC患者的肌動蛋白絲相關蛋白1-反義RNA 1（AFAP1-AS1）明顯高于對照組，患者血清中AFAP1-AS1高表達與遠處轉移、淋巴結轉移、臨床分期差、腫瘤體積大相關［15］。LncRNA參與表觀遺傳機制的調控，其可作為癌癥治療中克服或逆轉耐藥的新指標和靶點［16］。有研究者在BCYRN1分子機制的相關研究中發現，包含E1的冷激結構域（CSDE1）通過異二聚體作用與BCYRN1結合，并存在相互的調節作用［17］。體內研究顯示，五味子乙素（Schisandrin B）通過上調miR-150降低BCYRN1的表達而影響大鼠氣道平滑肌細胞的增殖和遷移［18］。3.3 BCYRN1在肺腺癌中的生物學功能 通過上述關于BCYRN1的相關研究，筆者試圖探究BCYRN1在肺腺癌細胞中的表達，并進一步研究BCYRN1對腫瘤細胞生物學行為的影響。本研究通過qPCR證實，BCYRN1在肺腺癌細胞內的表達水平顯著高于正常肺上皮細胞。流式結果顯示，BCYRN1敲低的細胞出現顯著的S期阻滯，并且凋亡細胞的比例也明顯升高。通過劃痕實驗和Transwell實驗發現敲低H1299細胞BCYRN1降低了細胞的遷移和侵襲能力。結合生物信息學分析結果，BCYRN1的高表達與肺腺癌患者的N分期和腫瘤分期相關。生存分析表明BCYRN1高表達的患者預后較差，與細胞功能實驗結果一致。

綜述所述，本研究證實BCYRN1在肺腺癌細胞中呈現高表達，肺腺癌中高表達的BCYRN1促進了癌細胞的惡性生物學行為，故推測BCYRN1在肺腺癌進展中可能有重要作用，但潛在分子機制仍有待深入研究和探討。