抗茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsis trachicarpicola)生物農藥復配組合篩選

饒家瑞， 周玉鋒*， 張金鋒， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省農業科學院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業科學院 生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶輪斑病是由擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、新擬盤多毛孢屬(Neopestalotiopsis)和假擬盤多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)的多種病原引起的茶樹葉部病害[1-4]，感病葉片呈褐色不規則圈狀大斑[5]。茶輪斑病發生為害嚴重茶園可導致茶葉大量減產。因此，針對茶輪斑病病原篩選具有抑菌活性的生物農藥，對保障茶產業健康綠色發展具有重要意義。【前人研究進展】采用化學農藥、生物農藥和生防菌對不同地區茶輪斑病的抑制活性研究較多[6-8]。郭世保等[9]研究顯示，25%阿米西、10%世高水分散粒劑、25%丙環唑、75%百菌清、50%苯菌靈、70%甲基托布津和80%多菌靈對茶輪斑病均有不同程度的抑菌活性，并以25%阿米西的EC50最佳，為 0.094 7 μg/mL；董照鋒[10]研究表明，6%春雷霉素可濕性粉劑、枯草芽孢桿菌和戊唑醇對茶輪斑病的菌絲生長與孢子萌發有較好抑制效果；楊文等[11]研究檸檬醛和香葉醇天然產物對茶輪斑病病原菌(P.theae)抑制活性的結果表明，檸檬醛和香葉醇在500 mg/L濃度下的抑菌活性均高于50%；洪永聰等[12]研究發現，枯草芽孢菌株TL2對茶輪班病的菌絲生長和分生孢子形成均有較好的抑制效果，且其抗菌活性主要是枯草芽孢菌產生的蛋白改變了茶樹體內超氧化物歧化酶(SOD)的活性，從而調節茶樹活性氧代謝平衡達到限制茶輪斑病擴散的目的。【研究切入點】針對茶園發生的茶輪斑病，篩選復配增效作用明顯的生物農藥組合用于茶區茶輪斑病的生物防控。【擬解決的關鍵問題】生物農藥具有低毒、可降解優點，對病害防控具有廣闊的應用前景[13]。對甲基營養型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農藥的抑菌活性進行初篩選，并挑選其中活性較優生物農藥進行復配，再采用菌絲速率生長法，測定活性較高生物農藥按不同比例復配混合后的抑菌活性及室內毒力強度。以期從中篩選出增效作用明顯的配方組合，為茶輪斑病的生物防控和茶產業的綠色健康發展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 茶輪斑病病原菌為張欣等[14]于2020年7月從貴州省銅仁市石阡縣采集，經單孢分離、結合形態學和系統發育研究，將分離病原鑒定為Pestalotiopsistrachicarpicola，并根據室內回接，驗證了其致病性。病原菌由貴州省農業科學院生物技術研究所提供。

1.1.2 藥劑 5種生物農藥和陽性對照藥(CK1)的名稱、成分含量、劑型及生產廠家見表1。無水乙醇，購于天津市富宇精細化工有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學試劑廠；PDA培養基，購于廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂粉，購買于成都歐恩瑞思化學試劑有限公司。其他試劑均為化學純或分析純，購于上海安耐吉化學試劑有限公司。藥品稱量，均在Sarfori-us型電子天平(精度0.000 1 g)上完成。

表1 5種生物農藥的基本信息

1.1.3 儀器 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BSA224S-CW電子天平，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等儀器。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

1) 5種生物農藥對茶輪斑病的抑菌活性試驗。以5種生物農藥為試驗對象，多抗霉素為陽性對照，吐溫80滅菌水為空白對照，共設7個處理，各濃度處理3次重復。根據表1生物農藥分別設為5個處理，陽性對照藥多抗霉素(CK1)，空白對照等量吐溫80滅菌水(CK2)。

2) 抑菌活性較好生物農藥復配的聯合毒力試驗。參照向曉龍等[15-16]的藥劑復配設計方法，選取試驗1)中抑菌活性較好的中生菌素(A)和四霉素(B)按不同比例進行混合復配，試驗共設10個處理，各濃度處理3次重復。處理1，A∶B為9∶1；處理2，A∶B為8∶2；處理3，A∶B為7∶3；處理4，A∶B為6∶4；處理5，A∶B為5∶5；處理6，A∶B為4∶6；處理7，A∶B為3∶7；處理8，A∶B為2∶8；處理9，A∶B為1∶9；處理10，為空白對照等量吐溫80滅菌水(CK3)。

1.2.2 不同濃度各生物農藥抗茶輪斑病的EC50測定

1) PDA培養基配制。按照購買的PDA培養基使用配方，在3 L清水中依次加入PDA粉120 g、瓊脂粉39 g，在攪拌狀態下煮沸4 min停火，冷卻10 min，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的錐形瓶中封口，在121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻備用。

2) 藥液配制。將200 μL吐溫80加入滅菌后的200 mL滅菌水中，攪拌均勻。分別稱取各生物農藥5 mg、2.5 mg、1.25 mg、0.675 mg和0.337 5 mg，并分別加入1 mL吐溫80滅菌水混勻，現加入4 mL滅菌水，使50 mL PDA培養基中各生物農藥的最終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL，再將含有各待測生物農藥的PDA培養基平均倒入3個培養皿中冷卻備用。

3) 病原接種。在消毒后的超凈工作臺上，用打孔器在事先活化好的茶輪斑病菌落邊緣打孔，制成直徑為4.0 mm的菌餅，然后用無菌接種針將菌餅接種到含有對應生物農藥的培養基中，將培養皿放于25℃、80%濕度的恒溫培養箱中培養5 d。待空白對照組菌絲生長至6.0 cm左右時，采用十字交叉法測量菌餅直徑[11]，用菌絲生長速率法測定各濃度生物農藥對茶輪斑病的抑菌活性，篩選抗茶輪斑病活性較高的生物農藥。以生物農藥濃度的對數為自變量(x)，相對抑制率為因變量(y)，取對數得到生物農藥對茶輪斑病的線性回歸方程，計算各生物農藥的抑制率、抑制中質量濃度EC50及相關系數(R2)。根據EC50判斷生物農藥的毒力大小。即生物農藥的EC50越小，其對茶輪斑病病原菌的毒力越強。

I= [(C-T)/(C-0.4)]× 100%

式中，I為抑制率，C為空白對照的菌絲直徑，T為藥物處理組菌絲直徑。

1.2.3 高活性生物農藥復配對P.trachicarpicola的EC50測定 采用菌絲生長速率法[18]，測定中生菌素和四霉素在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下，按不同比例復配藥液對該病原的抑制率，采用1.2.2中公式計算出對應濃度下的抑制率，再對生物農藥濃度取對數與其相應抑制率做線性回歸方程，從而得出其EC50。

1.2.4 復配藥劑的共毒系數 采用菌絲生長速率法測定按不同比例復配混合生物農藥的抑菌活性及室內毒力強度。利用SUN等[17]的毒力評判法計算復配農藥的共毒系數CTC(co-toxicity coefficient)，并以CTC值評判2種藥劑的聯合毒力作用。CTC值小于80為拮抗作用，大于120為增效作用，80～120為相加作用。計算公式如下：

1.3 數據處理

采用Excel 2010和DPS 7.05對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 5種生物農藥對 P. trachicarpicola的抑制率及毒力強度

2.1.1 不同濃度生物農藥對P.trachicarpicola的抑制率 由表2可知，5種生物農藥在100～6.75 μg/mL濃度下對P.trachicarpicola的抑制率，均隨藥劑濃度的減小而降低，且各濃度間差異均達極顯著。說明，抑制率和其對應藥物的濃度均呈較好線性關系，測定EC50的可信度高。在5種生物農藥中，以枯草芽孢桿菌對該病原的抑制率最好，在100～6.75 μg/mL濃度下的抑制率為94.44%～61.42%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高27.77～51.23百分點；中生菌素其次，抑制率為95.06%～28.09%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高28.39～17.90百分點；甲基營養型芽孢桿菌LW-6第3，抑制率為79.94%～35.19%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高13.27～25.00百分點；四霉素與對照藥多抗霉素相當；木霉菌在各梯度濃度下的抑制率略低于陽性對照藥。

表2 不同濃度下5種生物農藥對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.1.2 毒力回歸方程 從表3可知，通過擬合得到的5種生物農藥對茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)的毒力方程為y甲基營養型芽孢桿菌LW-6=0.994 7x+3.814 2(R2=0.993 1)，y木霉菌=1.805 7x+1.723 1(R2=0.960 6)，y中生菌素=1.823 5x+2.845 4(R2=0.978 6)，y枯草芽孢桿菌=1.066 2x+4.349 6(R2=0.980 6)，y四霉素=1.290 4x+2.876 3(R2=0.996 4)，y多抗霉素=1.405 8x+ 2.651 6(R2=0.995 6)，相關系數均>0.95，表明5種生物農藥及對照藥多抗霉素的濃度與抑制率間均存在良好的線性關系。

2.1.3 毒力強度 由表3看出，甲基營養型芽孢桿菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素的EC50分別為15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分別比陽性對照藥多抗霉素(46.83 μg/mL)減少用藥量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。說明，枯草芽孢桿菌的毒力強度最大，甲基營養型芽孢桿菌LW-6和中生菌素其次，四霉素稍差，且效果均優于對照藥多抗霉素。

表3 5種生物農藥對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的毒力回歸方程及EC50

2.2 中生菌素和四霉素復配藥劑對P. trachicarpicola的抑制率及毒力強度

2.2.1 復配藥劑對P.trachicarpicola的抑制率 由表4可知，在100 μg/mL濃度下，9種不同比例復配藥劑對P.trachicarpicola的抑制率以處理1最高，為90.97%；處理3次之，為89.58%；處理2第3，為89.24%。處理1除與處理2～5差異不顯著外，與處理6～9差異極顯著。雖然隨著四霉素在復配藥劑配方中的占比率增加，對P.trachicarpicola的抑制率呈依次緩慢下降趨勢，但仍高于四霉素在100 μg/mL時的抑制率(65.74%)。說明，復配對藥劑活性的提升具有一定作用。

表4 5種生物農藥(100 μg/mL)對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.2.2 復配藥劑對P.trachicarpicola的室內毒力強度 從表5可知，A∶B為9∶1復配藥劑的抑制活性最佳，EC50為12.03 μg/mL；A∶B為8∶2復配藥劑次之，EC50為16.34 μg/mL；隨著四霉素在復配藥劑中的占比不斷增加，復配藥劑的EC50呈上升趨勢。當A∶B為1∶9時，其EC50達30.95 μg/mL，但仍然低于四霉素單劑EC50的毒力值44.24 μg/mL。9種復配藥劑的相關系數均大于0.95，說明復配藥劑的濃度與抑制率間均存在良好的線性關系，結果可信。

2.2.3 復配藥劑的共毒系數及聯合毒力強度 從表5看出，在中生菌素和四霉素復配的9種藥劑中，處理1、處理2、處理3和處理4的聯合毒力強度為增效，共毒系數依次為310.51、197.82、147.99和134.52；處理5和

表5 中生菌素和四霉素復配藥劑的毒力回歸方程、EC50、共毒系數及聯合毒力

處理6為相加，共毒系數為117.70和97.80；處理7、處理8和處理9為拮抗，共毒系數依次為77.83、63.13和53.76。說明，A∶B=9∶1復配藥劑的增效作用最明顯，可以嘗試用于田間茶輪斑病的生物防控，復配藥劑的聯合毒力強度整體隨四霉素占比增加呈下降趨勢，證明中生菌素在復配藥劑中的占比對其藥劑活性的影響較大。

3 討論

茶輪斑病可由多種病原菌引起，為針對不同病原有效地進行茶園防控，洪永聰等[12]研究表明，枯草芽孢菌株TL2對茶輪斑病有較好的抑制效果。因此，以茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)為目標菌種，用甲基營養型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農藥對其EC50進行篩選，選擇活性較好的中生菌素和四霉素按照不同比例進行復配，并測試不同配比復配組合的EC50。

甲基營養型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農藥在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下對茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)的抑制率均隨藥劑濃度的減小而降低，且各濃度間差異均達極顯著。甲基營養型芽孢桿菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素的EC50分別為15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分別比陽性對照藥多抗霉素(46.83 μg/mL)減少用藥量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。即5種生物農藥的EC50以枯草芽孢桿菌最低，為4.07 μg/mL；中生菌素其次，為15.19 μg/mL；甲基營養型芽孢桿菌LW-6第3，為15.56 μg/mL。

中生菌素和四霉素復配藥劑在100 μg/mL濃度下對P.trachicarpicola的抑菌活性測定結果顯示，9種復配藥劑組合中，以中生菌素∶四霉素為9∶1藥劑對茶輪斑病病原菌的抑制率最高，為90.97%；中生菌素∶四霉素為7∶3次之，為89.58%；中生菌素∶四霉素為8∶2第3，為89.24%。雖然隨著四霉素在復配藥劑組合中的占比率增加，其對茶輪斑病病原菌的抑制率呈依次緩慢降低趨勢，但仍然高于四霉素在100 μg/mL時對P.trachicarpicola的抑制率(65.74%)。說明，復配組合對藥劑活性的提升具有一定作用。

根據SUN等[17]的毒力評判方法計算復配組合的共毒系數(CTC)。以CTC值評判中生菌素和四霉素2種藥劑的聯合毒力作用，CTC<80為拮抗作用，CTC>120為增效作用，CTC為80～120為相加作用。9種不同復配藥劑的EC50測定結果表明，中生菌素∶四霉素為9∶1復配組合藥劑對P.trachicarpicola的抑制活性最佳，EC50為12.03 μg/mL；中生菌素︰四霉素為8∶2其次，EC50為16.34 μg/mL；中生菌素∶四霉素為7∶3第3，EC50為19.25 μg/mL。中生菌素∶四霉素為(9～6)∶(1～4)復配藥劑的聯合毒力均大于120，表現為藥劑增效，并以中生菌素∶四霉素為9∶1的聯合毒力最大，為310.51，表現出較好的藥劑增效作用。

4 結論

研究結果表明，中生菌素∶四霉素為9∶1復配組合的EC50(12.03 μg/mL)均低于單一中生菌素(15.19 μg/mL)和四霉素(44.24 μg/mL)，其共毒系數為310.51>120，具有增效作用，但還應進一步在田間開展藥效試驗進行評價。因此，篩選對茶輪斑病抑制效果明顯的復配生物農藥組合，對茶園減施化學農藥用量、降低農藥殘留和提高茶葉產量和品質具有重要意義。