抗蟲耐除草劑玉米對大鼠的亞慢性毒性研究

周殿明，張大龍，張靜，何寧，高崢，張倩，周曉麗，錢智勇

(天津市疾病預防控制中心毒理科，天津300011)

玉米已經成為僅次于小麥和水稻的第三大谷類作物，是全世界多個國家的重要糧食和經濟作物。但是，許多生物或非生物的影響，如害蟲、自然氣候和雜草等，往往會對玉米產業造成巨大損失。近年來，生物技術尤其是轉基因生物技術的發展為玉米育種在抗除草劑和抗病蟲害方面提供了一條新的解決途徑。

本研究使用的轉基因玉米中轉入cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT 5個 基 因。cp4epsps基因來自農桿菌CP4菌株，能夠編碼產生新的芳香氨基酸生物合成用蛋白，該蛋白對草甘膦的親合力大大降低，從而能使植物產生草甘膦抗性。Cry1Ab和Cry3Bb均屬于Bt類蛋白，Bt蛋白由蘇云金芽孢桿菌產生。Cry1Ab可以抵御歐洲玉米螟，西南玉米螟和亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲。Cry3Bb主要作用于玉米雙斑螢葉甲等鞘翅目類昆蟲。但是，Bt蛋白本身對人類沒有任何毒性。ZmHPT來自玉米本身，可以提高植物體內的維生素E總含量。ZmTMT同樣來自玉米，可以把低活性的γ-生育酚轉化為高活性的α-生育酚。兩個基因的結合可以顯著提高玉米的α-生育酚含量，滿足動物飼料的需要。本轉基因玉米產品轉入5個基因后，使其具有抗蟲、抗草甘膦以及高維生素E含量的特性，具有重要的食用和經濟價值，其安全性評價也就具有重要意義。

但是，轉基因生物的安全問題，即是否具有潛在的人體危害已經受到全球范圍內廣泛關注，成為社會熱點問題。因此轉基因生物的食用安全評價也成為該領域的重要工作。近年來，轉基因玉米的食用安全性評價已開展了大量研究工作，主要包括理化實驗和毒理學實驗。雖然大部分轉基因玉米經過食用安全性評估表明其不具有不良反應，但是每一個新的轉化事件的安全性仍需要根據個案評估的原則進行研究。本研究依據“實質等同性”原則，按照《NY/T 1102—2006轉基因植物及其產品食用安全檢測：大鼠90 d喂 養 試 驗 標 準》對 轉cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑玉米進行了大鼠90 d喂養實驗，了解分析該轉基因玉米是否會對大鼠產生亞慢性毒性作用，為該轉基因玉米的食用安全性評價提供一定的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 樣品

轉cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質性狀改良玉米和非轉基因對照(親本)玉米樣品2~8℃條件下儲存。

1.2 主要儀器和試劑

Sysmex XT-2000i五分類血球計數儀，TOSHIBA TBA-40FR全自動生化分析儀，徠卡EG1140H+C包埋機，徠卡2145切片機，徠卡HI1201攤片機，徠卡ASP300脫水機，Olympus BX53DP72病理圖像分析系統，賽多利斯CP323S電子天平，賽多利斯TE6100-L電子天平。全自動血液分析儀專用試劑(天津鼎信醫療科技有限公司)，血生化檢測試劑盒(北京九強生物技術有限公司)。

1.3 實驗動物和飼養條件

選取SPF級Wistar大鼠140只，6周齡，雌雄各半。實驗在天津市疾病預防控制中心SPF級動物房中進行。環境溫度20～24℃，相對濕度40%～70%，采用人工照明按12 h/12 h明暗交替，換氣次數15次/h。動物分籠喂養，自由進食和飲水。

1.4 劑量設計與飼喂方式

普通飼料適應性喂養4 d后，動物按性別、體質量隨機分成7組，每組20只，雌雄各半。基礎飼料對照組：飼喂基礎維持飼料；對照玉米低劑量組：飼喂含12.5%非轉基因對照玉米的配制飼料；對照玉米中劑量組：飼喂含25%非轉基因對照玉米的配制飼料；對照玉米高劑量組：飼喂含50%非轉基因對照玉米的配制飼料；轉基因玉米低劑量組：飼喂含12.5%轉基因玉米的配制飼料；轉基因玉米中劑量組：飼喂含25%轉基因玉米的配制飼料；轉基因玉米高劑量組：飼喂含50%轉基因玉米的配制飼料。飼喂時長為90 d。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 動物的一般觀察

每日觀察動物的活動情況、毛色、攝食及排泄情況，中毒癥狀及出現時間和死亡情況。觀察大鼠生長發育情況，記錄每周大鼠進食量和體質量，實驗結束后計算每周進食量、體質量、食物利用率及總進食量、總體質量增量、總食物利用率。

1.5.2 血常規檢測

實驗末期動物禁食16 h后按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血。取EDTA·K抗凝全血測定紅細胞壓積、血小板計數(PLT)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細胞計數(WBC)及其分類，凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。

1.5.3 血生化檢測

取全血凝集離心后的血清測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿 素 氮(BUN)、肌 酐(CREA)、總 膽 固 醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、氯(Cl)、鉀(K)、鈉(Na)生化指標。

1.5.4 解剖臟器及病理組織學檢查

解剖動物進行大體病理學檢查，取腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、附睪、子宮、卵巢稱量絕對質量，計算臟器相對質量(臟/體比值)。實驗結束時解剖取出實驗動物的腦、垂體、心臟、肝、肺、脾、腎、前列腺、腎上腺、胃及十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、甲狀腺、胸腺、睪丸和附睪、卵巢和子宮，各臟器各取一塊組織浸入4%中性甲醛固定液中固定，制作石蠟組織切片，常規HE染色后，病理組織學顯微鏡下觀察臟器組織學病理變化，記錄異常變化。

1.5.5 數據處理

數據以平均值±標準差的形式表示。多組間比較采用方差齊性檢驗，如果方差齊，進行單因素方差分析(one way ANOVA)；如果方差不齊，進行非參數檢驗。各劑量轉基因玉米組分別與對應劑量的對照玉米組進行比較，各試驗組再與基礎飼料對照組進行比較，以

P

<0.05判定為顯著性差異。

2 結果

2.1 日常觀察

結果顯示，試驗期間各組動物活動自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無異常分泌物，無中毒死亡情況發生。

2.2 轉基因玉米對大鼠體質量與進食量的影響

大鼠體質量與進食量見表1，雄性動物對照玉米中劑量組和轉基因玉米中劑量組體質量增量高于對照組，對照玉米中劑量組總進食量高于對照組，對照玉米低劑量組、轉基因玉米低劑量組和轉基因玉米高劑量組食物利用率高于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；雌性動物體質量增量、總進食量和總食物利用率與對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。其余各組進食量和體質量與對照組比較差異均無統計學意義(

P

>0.05)

表1 大鼠的體質量增量、總進食量與總食物利用率(n=10，x±s)

2.3 轉基因玉米對大鼠臟器系數的影響

轉基因玉米對大鼠臟器系數的影響見表2：雄性動物對照玉米中劑量組腦/體比低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。雌性動物轉基因玉米高劑量組子宮/體高于對照玉米高劑量組，對照玉米低劑量組脾/體高于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。但未見其生物學意義；其余各組臟器系數與對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。

表2 各組大鼠臟器系數表(%，n=10，x±s)

2.4 轉基因玉米對大鼠血液生化指標的影響

轉基因玉米對大鼠血液生化指標的影響見表3。實驗末期，雄性動物轉基因玉米高劑量組ALB高于對照玉米高劑量組；對照玉米中劑量組GGT和BUN高于對照組，對照玉米高劑量組CRE和CHO低于對照組，轉基因玉米低劑量組CRE低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；但未見生物學意義。雌性動物對照玉米低劑量組AST低于對照組，對照玉米中劑量組ALP高于對照組，對照玉米高劑量組CHO低于對照組，轉基因玉米低劑量組CHO低于對照組，轉基因玉米中劑量組ALP低于對照玉米中劑量組，BUN高于對照組，CHO低于對照組，CRE低于對照玉米中劑量組，轉基因玉米高劑量組BUN高于對照玉米高劑量組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；雄性動物中，對照玉米中劑量組、對照玉米低劑量組和轉基因玉米低劑量組Na低于對照組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；轉基因玉米中劑量組Na高于對照玉米中劑量組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；轉基因玉米低劑量組K高于對照玉米低劑量組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；對照玉米中劑量組和對照玉米高劑量組Cl低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；轉基因玉米高劑量組Cl高于對照玉米高劑量組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；雌性動物中，轉基因玉米中劑量組Na高于對照組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；對照玉米高劑量組K高于對照組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；轉基因玉米低劑量組Cl高于對照玉米低劑量組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；但未見生物學意義。其余各組各項生化指標與對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。

表3 大鼠血液生化指標(n=10，x±s)

2.5 轉基因玉米對大鼠血常規指標的影響

轉基因玉米對大鼠血常規指標的影響見表4，實驗末期，雄性動物轉基因玉米低劑量組中性粒細胞百分比高于對照組和對照玉米低劑量組，轉基因玉米中劑量組中性粒細胞百分比高于對照組和對照玉米中劑量組，轉基因玉米中劑量組淋巴細胞百分比低于對照組和對照玉米中劑量組，轉基因玉米中劑量組單核細胞百分比高于對照玉米中劑量組，對照玉米低劑量組和轉基因玉米中劑量組紅細胞壓積百分比低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；雌性動物對照玉米低劑量組血小板計數和單核細胞百分比均低于對照組，對照玉米高劑量組血小板計數低于對照組，嗜酸細胞百分比高于對照組，轉基因玉米低劑量組單核細胞百分比高于對照玉米低劑量組，轉基因玉米中劑量組單核細胞百分比高于對照玉米中劑量組，轉基因玉米高劑量組嗜酸細胞百分比低于對照玉米高劑量組，差異有統計學意義(

P

<0.05)；但未見生物學意義。雄性動物轉基因玉米低劑量組和轉基因玉米中劑量組凝血酶原時間低于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。上述指標均在本檢測單位正常值范圍內，無劑量反應關系，無生物學意義。其余各組各項指標與對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。

表4 大鼠血常規指標(n=10，x±s)

2.6 病理組織學檢查結果

試驗結束后，解剖大體觀察各組主要臟器未見明顯病變。通過鏡下觀察，轉基因高劑量組、親本高劑量組與對照組比較，未發現轉基因樣品引起實驗動物典型病理組織學改變和特異性損傷改變。

3 討論

將轉

cry1Ab

、

cry3Bb

、

cp4epsps

、

ZmHPT

和

ZmTMT

基因抗蟲耐除草劑品質性狀改良玉米和非轉基因對照玉米分別摻入飼料(比例分別為50%、25%、12.5%)喂飼大鼠90 d，試驗期間各組動物活動自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無異常分泌物，無中毒死亡情況發生。試驗期間，部分對照玉米組和轉基因玉米組動物體質量、進食量與常規基礎飼料對照組比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)，部分轉基因玉米組動物體質量、進食量與對照玉米組比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)，但均未見其生物學意義；其余各組動物體質量增量、總進食量和總食物利用率與相應對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。個別轉基因玉米組和對照玉米組動物臟體比與常規基礎飼料對照組比較有顯著性差異(

P

<0.05)，個別轉基因玉米組動物臟體比與對照玉米組比較差異有統計學意義(

P

<0.05)，但無生物學意義；其余各組動物臟體比值與相應對照組比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。

實驗末期對照玉米組和轉基因玉米組部分血液學指標、血生化指標與常規基礎飼料組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，轉基因玉米組部分血液學指標、血生化指標與對照玉米組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，但均在本檢測單位正常值范圍內，無劑量反應關系，無生物學意義。動物解剖時，大體觀察未發現異常。病理組織學檢查未發現轉基因樣品引起實驗動物有典型病理組織學改變和特異性損傷改變。

綜上所述，采用轉cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質性狀改良玉米進行大鼠90 d毒性實驗未發現明顯的生物學意義。本研究還將結合理化檢測實驗、轉基因表達蛋白的急性毒性實驗等研究，綜合評價該轉基因玉米的食用安全性，為進一步的安全性評價提供重要實驗依據。