聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析復方川貝散中川貝母成分

張國林，魏星，邢以文，薛滿

貝母為百合科植物干燥鱗莖，具有清熱潤肺、止咳化痰的藥理活性。貝母常見品種有川貝母（Fritillariae cirrhosae bulbus）、浙 貝 母（Fritillariae thunbergii bulbus）、平貝母（Fritillarae ussuriensis bulbus）和伊貝母（Fritillariae pallidiflorae bulbus）等。貝母屬川貝母止咳化痰效果優于其他貝母，但由于川貝母資源短缺、價格較高，市場上存在摻假摻偽的現象。同時，川貝母多以藥材原粉入藥，給采用常規方法鑒別帶來較大困擾。川貝母ITS區的第75位堿基為C，含有CCCGGG序列的SmaI酶切位點，而非川貝類此位點為T，是CTCGGG序列，無

SmaI

酶切位點。基于此，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性方法（PCR-RFLP）可以實現從分子水平上對川貝母的鑒別。雖然目前有關于分子生物學方法鑒定川貝母的報道，但關于中藥制劑中采用分子生物學方法鑒定川貝母的報道較少。本研究研究起止時間為2019年2月至2019年5月，采用PCR-RFLP法對復方川貝散中的川貝母成分進行分析，并以含有平貝母成分的蛇膽川貝液為對照。

1 材料與方法

1.1 藥品

國家藥品標準物質川貝母（暗紫貝母）（中國食品藥品檢定研究院，批次121000～201609）；復方川貝散（處方為川貝母、浙貝母和珍珠）（蘇州大學附屬兒童醫院，批號Z04001116，批次20190307）；蛇膽川貝液（廣東一力羅定制藥有限公司，批號Z44023603，批次180201）；川貝母（無錫葆壽堂藥業有限公司，批次Y181204）；珍珠層粉（蘇州工業園區天龍制藥有限公司，批號Z32020625，批次CF190206）。

1.2 試劑與儀器

新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱）購自上海捷瑞生物工程有限公司（批號0020170104）；Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）購自美國賽默飛世爾科技有限公司（批號00517449）；20μmol引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（上游引物批號2409103320，下游引物批號2409103319）；Nuclease-free Water購自美國賽默飛世爾科技有限公司（批號00513931）；50×TAE緩沖液購自美國Solarbio公司（批號20170620）；AGEAROSE G-10瓊脂糖購自西班牙BIOWEST公司（批號111860）；GelRed購自美國Biotium公司（批號14G0805）；10×T Buffer（BSA free）購自日本TaKaRa公司（批號A1801A）；0.1%牛血清白蛋白購自日本TaKaRa公司（批號A4201A）；SmaⅠ購自日本TaKaRa公司（批號AGX0152A）；TissueLyserⅡ組織破碎儀購自德國QIAGEN公司；MK-10干式恒溫器購自杭州奧盛儀器有限公司；Lab Dancer漩渦混合器購自德國IKA公司；Transferpette? S移液槍購自德國BRAND公司；Biofuge Primo R高速冷凍離心機購自美國賽默飛世爾科技有限公司；Veriti96熱循環儀購自美國應用生物系統公司；PowerBac Basic電泳儀基礎電源購自美國伯樂公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統購自美國伯樂公司；PURA10通用水浴槽購自優萊博技術（北京）有限公司。

1.3 DNA提取

DNA提取根據新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱）說明書操作。提取完成后用50 μL洗脫緩沖液EB洗脫提取物，將收集的DNA于-20℃保存待用。國家藥品標準物質（暗紫貝母）取樣量約50 mg，復方川貝散取樣量約50 mg，蛇膽川貝液取樣量為50 μL。

1.4 PCR擴增

PCR擴增體系為50 μL：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）25 μL；20 μmol正向引物1 μL；20 μmol反向引物1 μL；無菌超純水21 μL；DNA模板2 μL。以無菌超純水代替DNA模板作為空白對照。PCR程序為：95℃、4 min；（95℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s）30個循環；72℃、5 min。引物序列：正向引物5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；反向引物5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

1.5 限制性內切酶酶切

酶切體系為20 μL：10×T Buffer（BSA free）2 μL；0.1% BSA 2 μL；PCR擴增產物12 μL；SmaⅠ（10 U/μL）1.5 μL；無菌超純水2.5 μL。酶切反應體系在30℃水浴中孵育2 h。以無菌超純水代替PCR擴增產物作為空白對照，其他操作均相同。

1.6 復方川貝散中川貝母靈敏度與檢出限

采用等量遞增法對川貝母粉和珍珠層粉進行混合進行靈敏度分析。設計川貝母含量分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%共6個梯度進行PCR-RFLP實驗。待確認靈敏度范圍后采用PCR-RFLP進行第二次等量遞增法確認靈敏度和檢出限。川貝母樣品采用組織破碎儀碎后使用（頻率30次/秒，5 min）。DNA提取、PCR擴增及酶切操作按照“1.3”～“1.5”方法進行。

2 結果

2.1 復方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴增及限制性酶切結果

復方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴增后均出現特異性條帶，但經SmaⅠ酶切后復方川貝散在100～250 bp之間出現兩條特異性酶切條帶，而蛇膽川貝液經SmaⅠ酶切后無特異性條帶。見圖1。

圖1 復方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴增及限制性酶切結果：A為復方川貝散和蛇膽川貝液PCR電泳結果；B為復方川貝散和蛇膽川貝液PCR產物限制性酶切電泳結果

2.2 復方川貝散中川貝母檢測靈敏度

對川貝母含量為0%、5%、10%、20%、30%、40%共6個梯度樣本進行實驗發現川貝母含量為5%時，PCR擴增后可出現明顯的特異性條帶，見圖2A。對上述6個梯度樣本PCR擴增產物采用SmaⅠ酶切后發現川貝母含量為5%時，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶，見圖2B。

圖2 復方川貝散中川貝母檢測靈敏度檢查：A為PCR擴增產物電泳圖；B為限制性內切酶電泳圖

2.3 復方川貝散川貝母檢出限

以川貝母含量為1%、2%、3%、4%、5%共5個梯度進行PCR-RFLP實檢測，發現川貝母含量為4%和5%時可得到特異性條帶。對上述5個梯度樣本PCR擴增產物采用SmaⅠ酶切后發現川貝母含量為4%和5%時，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶。見圖3。

圖3 復方川貝散川貝母檢出限：A為川貝母檢測限PCR產物電泳圖；B為川貝母檢測限PCR產物SmaI酶切電泳圖

3 討論

復方川貝散具有止咳化痰、清熱鎮驚的藥理活性，臨床上可用于外感風熱咳嗽或痰火郁結、肝火犯肺之久咳、痙咳等。復方川貝散是川貝母、浙貝母、珍珠制成的。川貝母由于資源少、價格高等原因，摻偽情況時有發生。由于中藥制劑中的川貝母通常為打粉入藥或提取物，故常規的顯微鑒別、薄層鑒別方法或藥師的經驗鑒別存在較大的局限性。PCR-RFLP是基于川貝母含有SmaⅠ酶切位點的特有ITS序列進行分析的，具有特異性高和靈敏度高的優點。本研究也證實復方川貝散和蛇膽川貝液PCR擴增后均出現特異性條帶，但復方川貝散經SmaⅠ酶切后在100～250 bp之間出現兩條特異性酶切條帶，而蛇膽川貝液經SmaⅠ酶切后無特異性條帶，提示復方川貝散中含有川貝母而蛇膽川貝液中不含川貝母。PCR-RFLP方法應用于鑒別中藥制劑中的川貝母可行。PCR-RFLP經過PCR擴增和限制性內切酶的酶切兩步完成的，其中待檢樣本中DNA分子的完整性是進行有效鑒別的物質基礎。復方川貝散屬于散劑劑型，各成分未經過提取或化學手段處理，DNA分子相對較為完整，因此采用PCR-RFLP可以實現有效的鑒別。筆者同時也對部分含有川貝母成分的中藥口服液進行了PCR-RFLP的實驗，但均未獲得有效的結果，推測可能是其中的DNA分子被破壞，無法進行有效的擴增所致。因此，PCR-RFLP方法鑒別中藥制劑中的川貝母成分需確保川貝母DNA分子完整，否則可能會出現假陰性結果。

PCR-RFLP屬于高靈敏度的檢測方法。為進一步分析不同川貝母含量樣本中的檢測靈敏度，我們制備了川貝母含量為0%、5%、10%、20%、30%、40%的6個梯度樣本進行了PCR-RFLP分析，結果證實川貝母含量為4%時PCR擴增產物采用SmaⅠ酶切后發現川貝母含量為5%時，在100～250 bp之間得到兩條特異性DNA條帶，提示PCR-RFLP可以對川貝母含量超過4%的樣本進行有效的檢測。但應當指出的是檢測的靈敏度除了與川貝母的含量有關外，也與樣本中DNA分子的完整程度以及制劑的制備工藝有關。同時，由于PCR-RFLP屬于高靈敏度檢測方法，若制劑的大量非川貝母中混有少量的川貝母成分，最終的檢測結果也可能會表現為陽性。在以后的工作中我們將進一步探索對制劑中川貝母成分定性分析的方法，為市場監管提供技術支撐。