阻斷PDL1的表達可增強膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性

文雪

摘要：目的：使用抗PDL1抗體阻斷PDL1/PD1通路，研究負性共刺激分子PDL1與膠質瘤細胞對化療藥物抵抗的相關性及免疫逃逸機制。方法 分離并活化人外周血淋巴細胞與膠質瘤細胞混合培養，同時加入化療藥物，流式細胞術檢測淋巴細胞及膠質瘤細胞的增殖情況。結果 抗PDL1抗體可以顯著活化淋巴細胞，同時促進膠質瘤細胞的凋亡。結論 阻斷PDL1/PD1通路可誘導淋巴細胞活化并促進致敏淋巴細胞介導的抗瘤效應。

關鍵詞：PDL1;膠質瘤;化療藥物

Abstract： Objective To use anti-PDL1 antibody to block the PDL1/PD1 pathway to study the correlation between the negative costimulatory molecule PDL1 and the resistance of glioma cells to chemotherapy drugs and the immune escape mechanism. Methods The mixed culture of human peripheral blood lymphocytes and glioma cells was separated and activated， and chemotherapy drugs were added at the same time. The proliferation of lymphocytes and glioma cells was detected by flow cytometry. Results Anti-PDL1 antibody can significantly activate lymphocytes and promote the apoptosis of glioma cells. Conclusion Blocking the PDL1/PD1 pathway can induce lymphocyte activation and promote the anti-tumor effect mediated by sensitized lymphocytes.

Keywords： PDL1; glioma; chemotherapy drugs

膠質瘤占所有原發性腦腫瘤的 51.4%，是成人中最常見的原發性腦腫瘤 [1]。然而，采用全手術切除繼以放療和輔助化療的標準治療，膠質瘤患者的生存率任然較低[2]。膠質瘤誘導局部和全身免疫抑制的能力限制了對腫瘤生長的先天防御和適應性免疫療法的功效，因此對新療法的開發提出了重大挑戰[3]。

程序性細胞死亡（PD）1受體及其配體（PDL1），可以抑制T淋巴細胞的活性[4]。在過去的 5 年中，使用 PD1 和 PDL1 單克隆抗體 （mAb） 進行免疫治療已產生顯著益處，在多種類型的腫瘤中具有持久的反應和可接受的治療相關毒性。本研究通過分離并活化人外周血淋巴細胞與膠質瘤細胞混合培養，同時加入化療藥物，通過體外實驗，探討負性共刺激分子PDL1在腫瘤逃避免疫攻擊中的作用及其機制。

1 材料及方法

1.1細胞及試劑 U251 細胞系為本實驗室凍存; DMEM培養基購自Gibco公司;胰酶購自Sigma公司;替莫唑胺（TMZ）購自先靈葆雅公司;抗PDL1抗體購自eBioscience公司;ConA購自Sigma公司;CFSE購自Sigma公司;凋亡試劑盒購自羅氏公司;替莫唑胺（TMZ）購自先靈葆雅公司。

1.2 細胞混合培養 分離并收集人外周血淋巴細胞，CFSE染色后，加入ConA（20ug/ml） 共孵育。48小時后，按照10：1的比例將淋巴細胞與U251 細胞種植于24孔板進行混合培養，分別加入TMZ（50μmol/L）和（或）抗PDL1抗體（30g/ml）共培養6天。分組如下：①淋巴細胞+ U251 ②淋巴細胞+ U251+ TMZ ③淋巴細胞+ U251+ TMZ+抗PDL1抗體。

1.3流式細胞術檢測 收集上述各組腫瘤細胞，然后用冰冷的PBS洗滌，按照凋亡試劑盒說明加入染料，采用流式細胞術檢測并分析凋亡結果。收集上述各組淋巴細胞，然后用冰冷的PBS洗滌，采用流式細胞術檢測并分析增殖結果。

1.4統計分析 利用SPSS version 12·0軟件進行t檢驗。

2 結果

①淋巴細胞增殖指數為6.3±2.4，U251凋亡率為12.8% ±5.3 ②淋巴細胞增殖指數為4.1±0.8，U251凋亡率為25.1% ±6.1 ③淋巴細胞增殖指數為10.2±3.3，U251凋亡率為45.6% ±4.7。結果表明，抗PDL1抗體能促進淋巴細胞活化并促進化療藥物的抗瘤效應。

3 討論

PDL1 在神經膠質瘤細胞中表達，與腫瘤分級相關，并有助于產生免疫抗性。 PD1/PDL1 通路在膠質瘤生物學中起著重要作用。在膠質瘤的免疫治療策略中使用抗 PD1/PDL1 抗體正引起越來越多的關注。為了提高抗PDL1免疫治療的療效，許多研究都集中在聯合治療上，包括靶向多種免疫抑制劑、放療、消融、化療等分子靶向治療。本研究利用抗PDL1抗體阻斷PDL1/PD1的同時聯合化療藥物，探討PDL1分子對活化淋巴細胞增殖以及腫瘤細胞凋亡的影響，結果證實阻斷PDL1的表達可增強膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性。

參考文獻：

[1]. Goodenberger ML， Jenkins RB. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 2012;205（12）：613–21.

[2]. Han F， Hu R， Yang H， Liu J， Sui J， Xiang X， Wang F， Chu L， Song S. PTEN gene mutations correlate to poor prognosis in glioma patients： a metaanalysis. Onco Targets Ther. 2016;9：3485–92.

[3]. Gousias K， Markou M， Arzoglou V， Voulgaris S， Vartholomatos G， Kostoula A， Voulgari P， Polyzoidis K， Kyritsis AP. Frequent abnormalities of the immune system in gliomas and correlation with the WHO grading system of malignancy. J Neuroimmunol. 2010;226（1–2）：136–42.

[4]. K?hnke T， Krupka C， Tischer J， Kn?sel T， Subklewe M. Increase of PD-L1 expressing B-precursor ALL cells in a patient resistant to the CD19/CD3-bispecific T cell engager antibody blinatumomab. J Hematol Oncol. 2015;8（1）：111.

基金項目：2020年度湖北省教育廳科學研究計劃指導性項目（B2020389）