辣椒輕斑駁病毒研究的回顧與展望

楊中周 鄧竹根 李曼 戴祖云

摘? ? 要：近年來，辣椒生產中辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）危害日趨嚴重，并影響到辣椒的品質和產量。綜述了辣椒輕斑駁病毒的危害性與分布、寄主范圍、在寄主組織中的分布與傳播途徑、基因組結構、致病型及親緣關系、檢測方法、防治方法等方面的研究進展，并對存在的相關問題進行分析與展望，以期為今后的PMMoV防治與抗性品種選育提供借鑒和參考。

關鍵詞：辣椒;辣椒輕斑駁病毒;寄主范圍;抗病育種;防治方法

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）09-001-06

Review and prospect of research on Pepper mild mottle virus（PMMoV）

YANG Zhongzhou1， DENG Zhugen1， LI Man1，2， DAI Zuyun1，2

（1. Anhui Jianghuai Horticulture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. College of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： In recent years， Pepper mild mottle virus （PMMoV）has become more and more serious in pepper production， and affects peppers quality and yield. For this reason， we summarize the harmfulness， geographic distribution， host range， distribution in host tissues， transmission， genome structure， pathotype， phylogenetic relationship， detection method， prevention and control of PMMoV. The prospects and analysis of the existing problems are also discussed in order to provide reference for the control of PMMoV and breeding of resistant varieties in the future.

Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus（PMMoV）; Host range; Resistance breeding; Prevention and control

2018年我國辣（甜）椒（Capsicum spp.）常年播種面積在200萬hm2，約占世界辣椒播種面積的40%，在蔬菜作物中穩居第一，成為我國蔬菜第一大產業[1-3]。病毒病是制約我國辣（甜）椒生產的一類重要病害，目前世界上報道能夠感染辣椒的病毒有60余種[4-5]，我國報道的種類在30種以上，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）仍是危害辣椒的最主要病害。但是，近些年辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）在一些地區已經成為了一種普遍發生的病害，特別是在江蘇地區，其平均檢出率高達62.28%[6]。在北京地區市場上銷售的商品種子陽性檢出率達61.11%，該病毒不但可以通過汁液摩擦傳播，而且還可以通過種子傳播，所以具有很大的潛在傳播性[7]。近幾年，國內外在PMMoV分布與寄主范圍、檢測方法、基因序列分析與親緣關系研究、抗病性品種選育等方面取得諸多重要進展，筆者著重對該病毒上述方面進行了總結，提出存在的問題和發展方向，以期為今后辣椒輕斑駁病毒病的研究提供理論參考。

1 PMMoV危害性與分布

PMMoV屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的無包膜正單鏈RNA病毒，是在世界范圍內造成辣椒重要經濟損失的一個重要病原[8]。辣椒葉片在被侵染后或表現癥狀不明顯，或出現褪綠斑駁和花葉癥狀;植株生長明顯變緩，發病越早，長勢受影響越大;果實被侵染后的癥狀較為明顯，表現為果小、果面有褪綠斑駁、凹凸斑點、甚至出現畸形與壞死現象。PMMoV可隨帶病的辣椒進入人體，經過消化排出人體后，仍具有侵染活性[9]。PMMoV最早于1964年在美國被發現[10]，其后在西班牙、德國、澳大利亞、阿根廷、匈牙利、荷蘭、加拿大、英國、保加利亞、韓國、越南、印度、巴基斯坦、塞爾維亞、意大利、土耳其、捷克、日本等國均有報道，并對一些地區的辣椒生產造成嚴重的經濟損失[11-20]。PMMoV于1994年在我國新疆石河子地區被首次報道[21]。至今，黑龍江哈爾濱[22]、四川汶川[23]、安徽和縣[24]、遼寧葫蘆島[25-26]、遼寧鳳城[27]、青海海東[28]、湖南[29]、吉林九臺[30]、上海奉賢[31]、貴州綏陽[8]、新疆巴州[32]、北京[33]、山東壽光[34-35]、江蘇南京[36]、河北保定[37]、廣西[38]、廣東[39]、海南[40]、云南[41]、寧夏[42]、西藏[6]等地區已有該病毒的相關報道。

2 PMMoV的寄主范圍

在自然條件下，PMMoV會侵染辣椒，因此，辣椒也首次被報道為PMMoV系統侵染的一個自然寄主。以往認為PMMoV的主要寄主包括茄科、藜科和莧科植物，會對其造成局部或系統侵染[43]。近些年，隨著全國對蔬菜病毒病的調查和診斷，明確PMMoV還能自然侵染茄科的番茄，葫蘆科的南瓜、黃瓜、西葫蘆、甜瓜，豆科的豇豆等作物，而且在江蘇葫蘆科蔬菜樣品中檢出率為83.33%，并與其他病毒發生復合侵染的頻率高且范圍廣。未發現PMMoV自然侵染十字花科的蘿卜、青菜、大白菜、甘藍、油菜、花椰菜、牛皮菜、芥菜、青花菜、白菜薹、菜薹和豆科菜豆、大豆的現象[6，44-45]。在中藥材方面，PMMoV能夠侵染延齡草科的滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis），使其出現花葉、斑駁和褪綠癥狀[46]。

3 PMMoV在寄主組織中的分布及傳播途徑

在侵染辣椒以后，PMMoV在辣椒的葉片、花瓣、花藥、花粉粒、果實、種子、根系等組織中廣泛分布[47]。然而，不同的組織器官間含量有差異，對同一個組織器官來說，又存在分布的不均一性。比如，葉片組織中的PMMoV含量明顯高于種子中的含量;在葉肉細胞中的含量明顯高于葉脈，且集中分布于葉肉細胞的柵欄組織中，其次是海綿組織，表皮組織中僅有少量分布;在種子中又主要集中在種皮，其次是胚乳靠近種皮的部分，而胚中無分布[48-49]。PMMoV雖在植物間不易介體傳播，但鑒于其在植物體中的分布情況，該病毒很容易通過種傳和汁液摩擦傳播。帶毒的種子以及被感染的植株是重要的傳染源，其中種子和花粉帶毒是其遠距離傳播的主要途徑[48，50]。

4 PMMoV的基因組結構

PMMoV病毒粒體呈直桿狀，基因組長6356 bp，共有4個開放閱讀框（Open reading frames，ORFs），編碼4個蛋白質：ORF1（70～3423 nt）編碼1個全長1117 aa，分子質量為126 kDa的蛋白質（包含甲基轉移酶和RNA螺旋酶區）;ORF2（70～4908 nt）編碼1個全長1613 aa，分子質量為183 kDa的蛋白質（包括RNA復制酶區）;ORF3（4909～5682 nt）編碼一個257 aa，分子質量約為28 kDa，與病毒移動相關的運動蛋白;ORF4（5685～6158 nt）編碼1個157 aa，分子質量約為17 kDa，用于保護病毒核酸且參與侵染的外殼蛋白。ORF1閱讀框終止于琥珀密碼子UAG，約有10%的概率可通讀ORF2。ORF1和ORF2所編碼的蛋白質與病毒RNA復制以及維管束運動有關。PMMoV的3末端和煙草花葉病毒屬的其他成員一樣具有類似t-RNA狀的二級結構[29，46，51]。

5 PMMoV的致病型及各分離物之間的親緣關系

L1、L2、L3、L4 四個L系列等位基因是辣（甜）椒抗煙草花葉病毒屬病毒的主要抗性基因[52]，根據煙草花葉病毒屬病毒對四種L抗性基因的致病性可將該屬病毒劃分成 P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4五種致病基因型。目前，國際上將發現的PMMoV致病基因型分為P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4三種，而中國大陸（遼寧、北京、山東青島、河北保定、新疆等地）的分離物都屬于P1，2致病基因型，而中國臺灣的分離物屬于P1，2，3致病基因型，從臺灣進口的種子檢測的結果也證實了這點[32， 51，53-54]。P1，2致病型病毒株系能夠系統侵染帶有L1、L2抗性基因的辣（甜）椒，而帶有L3、L4抗性基因的辣（甜）椒對該病毒株系表現有抗性;P1，2，3致病型病毒株系能夠系統侵染帶有L1、L2、L3抗性基因的辣（甜）椒，帶有L4抗性基因的辣（甜）椒對該病毒株系表現有抗性;P1，2，3，4致病型病毒株系能夠攻克L4基因抗性。從進化關系來看，P1，2，3與P1，2，3，4分別是由P1，2和P1，2，3正向選擇進化而來。

近幾年，隨著越來越多分離物的全基因序列在GenBank上登錄，更多的基礎信息為人們所知。研究者們開始對這些序列進行同源性分析和系統進化分析，以期探索各分離物之間的親緣關系，解決更深層次的進化問題。李麗麗等[22]的研究結果顯示，PMMoV中國分離物Hrb與GenBank中已報道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組序列的同源性為94.0%～99.6%;基于辣椒輕斑駁病毒基因組運動蛋白及外殼蛋白序列的系統進化分析結果顯示，Hrb與日本分離物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）親緣關系較近;與西班牙分離物PMMoV-Ia親緣關系較遠。楊林毅等[46]將中國云南曲靖分離物PMMoV-QJ與10個PMMoV分離物基因全序列進行比對分析，結果顯示同源性為99.42%～99.81%，同源性較高;PMMoV-QJ與中國遼寧葫蘆島分離物PMMoV-Huludao、2個韓國分離物PMMoV-LS和PMMoV-RP的親緣關系較近。韓帥等[23]的研究結果顯示，中國四川汶川分離物PMMoV-WC與中國北京分離物PMMoV-CN親緣關系較近，而與西班牙分離物PMMoV-Ia親緣關系較遠。嚴丹侃等[24]將安徽和縣的分離物PMMoV-AH與12個國內外PMMoV分離物的外殼蛋白基因序列進行系統發育分析，發現PMMoV-AH與包括PMMoV-CN在內的9份亞洲分離物的親緣關系較近，而與西班牙分離物PMMoV-Ia、意大利分離物PMMoV-I和以色列分離物PMMoV-Is親緣關系較遠。劉湘寧等[29]通過一致性分析發現，湖南辣椒分離物PMMoV-HN1與17種PMMoV病毒分離物的一致性在94.2%～99.7%之間;系統進化分析顯示PMMoV-HN1與PMMoV-CN的親緣關系最近，與PMMoV-Ia和韓國分離物PMMoV-P3親緣關系較遠。竹懷婷等[27]的研究表明，遼寧鳳城分離物的 PMMoV-FC與9個PMMoV分離物序列同源性為94.4%～99.7%，同源性很高;PMMoV-FC與6個來自中國、日本、韓國和美洲的分離物親緣關系較近，而與PMMoV-Ia和PMMoV-P3相對較遠。李曉冬等[26]分析了遼寧分離物PMMoV-LN與13個國內外PMMoV分離物的同源性，結果顯示其同源性為94%～100%，系統進化分析表明PMMoV-LN和10份來自于亞洲的分離物親緣關系密切;且與國內分離物具有相同的進化祖先，而與PMMoV-I、PMMoV-Is、PMMoV-Ia親緣關系較遠。王少立等[34]認為，中國山東分離物SD60與中國貴州分離物KC571248的相似性最高且親緣關系最近，而與以色列分離物EF422083、土耳其分離物HE963028和西班牙分離物HG514455等親緣關系較遠。總體而言，中國分離物之間普遍存在較高的同源性，且與許多亞洲、美洲分離物之間的親緣關系較近，而與西班牙、意大利、以色列的分離物之間的親緣關系較遠。

6 PMMoV的檢測方法

國內外對PMMoV檢測的方法有生物學方法、電鏡技術、血清學測定法（酶聯免疫吸附測定）和以核酸為基礎的分子生物學測定法（RT-PCR和實時熒光RT-PCR法）。目前以酶聯免疫吸附測定法（ELISA）和RT-PCR法最為常用。

通過鑒定寄主反應與范圍、交叉保護反應和傳毒方式進行植物病毒病診斷的生物學方法是植物病毒檢測的傳統技術。該技術是其他方法的重要基礎，具有直觀的特點，曾被廣泛應用[21]，然而該技術具有需要隔離溫室、種植大量鑒別寄主、檢測樣品數量有限、耗時長、受環境和季節影響較大等劣勢，已經無法滿足當前大批量的快速診斷和田間檢測需求。

結合超薄切片、負染色和血清學電鏡技術可直觀地觀察病毒粒體的形態結構和寄主細胞的結構變化[21]，特別是結合血清學技術之后，電鏡技術更加靈敏，成為植物病毒研究的一個重要手段。然而該項技術需要人員具有較強的專業知識背景，且設備昂貴，在實際檢測中使用頻率也相較ELISA和RT-PCR低，因此在實際大批量病毒檢測中運用較少。

采用固相吸附，將免疫反應和酶高效催化反應有機結合的ELISA具有操作簡單、檢測時間短、靈敏性高、特異性強等特點，目前在蔬菜種苗的PMMoV檢測中發揮重要作用[8，27，32，46，54]。在野外工作中，也可使用PMMoV膠體金免疫層析試紙條對樣本進行快速檢測[24]。

RT-PCR是以PCR為基礎的衍生技術，該項技術相較ELISA具有更高的靈敏度[7]、更強的特異性，同時可以突破血清學方法的局限，能夠鑒定同種病毒的不同株系。目前該項技術已被大量地運用到PMMoV檢測中[22-28，30-32，43，46，54]。郭京澤等[55]所建立PMMoV實時熒光PCR檢測方法靈敏度是DAS-ELISA法的100倍，且檢測簡便、快速，能夠很好地滿足種苗快速診斷和進出口檢驗檢疫需求。

7 PMMoV的防治方法

PMMoV具有種傳特性，帶毒種子是病毒長距離傳播的重要途徑。另外PMMoV可隨辣椒制品進入人體體內，經消化排出后，仍具有侵染活性[9，56]。鑒于此，加強種子及辣椒制品的檢疫是防治其快速蔓延的重要途徑。開展抗病育種是防治該病毒的最有效方式之一。L系列等位基因（L1、L2、L3、L4）是抗煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的主要抗性基因[52]。L3和L4基因對國內的PMMoV致病型P1，2具有抗性，已在國內外辣（甜）椒抗煙草花葉病毒屬育種上得到應用。Hiroshi等[57]發現WA31-1500S與L4緊密連鎖，遺傳距離在1.5 cM以內，該標記可以用于抗性資源的篩選。張寶璽等[41，58-59]構建了與L3、L4等抗性性狀緊密連鎖的分子標記，并通過回交轉育結合分子標記輔助選擇，選育出含有L3抗性的甜椒品種，并將L4基因也轉育到多份自交系材料中，以期望解決商業種植中的抗病問題。

此外，常規種子及土壤消毒處理也是有效的保護措施。隨著溴甲烷（MeBr）用于包括PMMoV在內的土傳病毒病熏蒸消毒的方法被禁止，一些新的方法被挖掘出來。如Jarret等[60]的研究表明，用10%磷酸三鈉（TSP），室溫下處理PMMoV感染的辣椒種子2.5 h，可以鈍化病毒;用10%TSP處理24 h，可使2/3的供試材料去除PMMoV。由于PMMoV能侵染藜科、莧科植物，而在藜科和莧科植物中，多數成員都是田間雜草，故而很可能田間雜草上也存在著PMMoV。因此對田間雜草連同田間感病作物進行清理、消毒顯得尤為重要。Aguilar等[61]的研究顯示，在西班牙東南部，堆肥中的高溫范圍在61.9～73.8 ℃，長時間的高溫使得病毒和真菌不能存活，使用PMMoV感染的植物殘體作為有機改良劑的堆肥似乎沒有將病原體重新引入土壤的風險，適合通過堆肥從被感染的作物殘體中充分清除PMMoV病原體。

除以上方法，也可以通過農事操作中的一些措施來減少PMMoV感染的概率。巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）和皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）的混懸液浸根能有效地抑制土傳PMMoV病害[62]。食油假單胞菌（Pseudomonas oleovorans）菌株KBPF-004對煙草病毒的機械傳播具有抗病毒活性[63]。Oka等[64]發現，商業纖維素酶對植物PMMoV感染有很強的抑制作用。用纖維素酶溶液對甜椒葉片進行預處理，可大大減少PMMoV感染植株的數量。注重對農事操作的機械器具的消毒，適當減少移栽時的根部受損和采收時的植株受傷，能夠明顯降低病毒傳播概率[65]。Rie等[66]利用減毒PMMoV分離物的交叉保護作用，提高已接種辣椒植株的抗性，獲得了較好的經濟效益。

8 問題與展望

隨著種子貿易和種質資源交流的日益頻繁，PMMoV已經成為一個世界性病害，嚴重威脅著辣椒的生產。在國內，其分布范圍也在逐年擴大，在一些地區已上升為主要病毒種類;相關寄主越來越多的被報道出來。之前認為不會被感染的一些作物，現在也成為了它的寄主，如番茄和葫蘆科的南瓜、西葫蘆、黃瓜、甜瓜等。目前中國大陸的致病型是P1，2，而從中國臺灣進口的種子里檢測到的致病型是P1，2，3，GenBank中更能查詢到西班牙、意大利、以色列的P1，2，3致病型和以色列的P1，2，3，4致病型。鑒于此，應加強種苗的檢測與檢疫工作，將PMMoV作為檢疫對象，列入《進境植物檢疫性有害生物名錄》，控制好侵染源頭，避免致病性更強的病毒擴散、蔓延。

目前，對于病毒病最常用的種子消毒方法是磷酸三鈉（TSP）法，然而用TSP處理種子，只能鈍化病毒，不能消除病毒的侵染性。長時間的TSP處理雖可使部分種子去除PMMoV，卻降低了辣椒種子的發芽率，顯著增加異常苗數量[60]。當前急需一套既能有效消除PMMoV侵染能力又不至于明顯降低種子發芽勢和發芽率的消毒方法，為種子的長距離調運保駕護航。

選育抗病品種無疑是最為高效經濟、綠色環保、便于推廣的對抗病毒病的手段。近些年，無論是國外還是國內，辣椒抗PMMoV的研究從病害檢測、資源引進、標記開發、新品種選育都有了長足發展。育種家通過輪回選擇和分子標記輔助選擇培育出一批含有L3抗性基因的商業品種。L3抗性基因雖然對P1，2致病型有抗性，但因有抗性基因的壓力，P1，2致病型會發生基因突變，攻克L3抗性，使得原先的抗病品種重新感病。接著育種家會選擇利用抗性更強的L4抗性基因選育新品種，如此交替進行。如何使品種獲得持久的抗病性是需要育種家認真考慮的問題。一方面需要尋找、鑒定出有別于L系列等位基因的新抗源，拓寬遺傳背景，并加以利用;另一方面可以將更多不同背景的抗性基因聚到一個品種中，使得病原株系很難通過一個位點的突變而攻克品種抗性。

近些年，隨著國內外越來越多的PMMoV分離物的基因組全序列被公布，開展分子變異特點等基礎性的研究工作，可為今后研究病毒擴散和有效防控提供理論指導。

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