固定化菌劑制備及對油田措施廢液殘渣的處理*

孫先鋒 柴曉蝶 趙 敏 任 鵬 吳蔓莉 肖宇婷

(1.西安工程大學環境與化學工程學院，陜西 西安 710048；2.長慶油田分公司油氣工藝研究院，陜西 西安 710018；3.西安建筑科技大學環境與市政工程學院，陜西 西安 710055)

油田措施廢液殘渣是油田開發過程中油水井作業后產生的廢液經污水站壓濾、離心等處理后得到的廢渣[1-2]，成分復雜，性質特殊，處理技術難度大，成本高，目前還沒有經濟可行的處理技術。因廢渣含有大量原油成分，郭蒲[3]采用污油泥的處理工藝對其進行處理，處理后的廢渣含油量小于5%(質量分數，下同)，原油的回收率達到90%。因此，可在含油污泥處理方法基礎上進行適應性優化研究，將其應用于油田措施廢液殘渣的處理。

目前可用于含油污泥處理的方法中，生物法以成本低、投資少、不易產生二次污染的獨特優勢被廣泛應用[4]。采用固定化技術制備微生物菌劑解決環境污染問題已成為生物法的發展趨勢[5]。固定化微生物菌劑具有獨立的微環境，可有效屏蔽土著菌的競爭及外界不利因素的影響，它以獨特的優勢被廣泛應用于石油污染土壤的生物處理[6-7]。

制備微生物固定化菌劑，載體應符合無毒性、成本低、可生物降解、含營養物質和傳質性能好等要求。隨著農業廢棄物的增多，國內外研究者逐漸傾向于利用農業廢棄物、農副產品以及由此制備的生物炭作為固定化載體[8]，目前使用作物秸稈為載體固定微生物進行石油污染土壤處理的研究較多[9-11]，[12]2710，但還未出現利用麩皮及麩皮炭作為固定化載體的研究，有研究表明小麥加工后的副產物麩皮含有極其豐富的營養物質，且來源廣，蓄積量大，價格低廉，具有廣闊的應用前景[13]。因此本研究分別以麩皮及麩皮炭為載體，制備固定化原油降解菌劑，并研究固定化菌劑對油田措施廢液殘渣的處理效果，以期為油田措施廢液殘渣規模化無害化處理提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

原油降解培養基：原油5.0 g/L，NH4NO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，無水CaCl20.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 實驗菌種

經分離篩選和馴化得到4株菌，編號分別為：J2、J4、J5、Ba-6，互不拮抗。

高效原油降解菌株：J2為動膠菌屬(Zooqloeasp.)，J4為黃單胞菌屬(Xanthomonassp．)，J5為葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)。

產表面活性劑菌株：Ba-6為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

1.1.3 油田措施廢液殘渣樣品

油田措施廢液殘渣樣品采自長慶油田某措施廢液集中處理站。

1.1.4 載體材料

麩皮：采購自延安市某面粉廠，無雜質，無霉變，含水率≤10%，粉碎后過80目篩。

麩皮炭：用蒸餾水將麩皮清洗一遍，60 ℃熱風烘干后粉碎機粉碎，置于坩堝中，馬弗爐300 ℃熱解4 h，研磨并過80目篩，制成生物炭[14]。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品基本理化性質

觀察油田措施廢液殘渣樣品的外觀形態、顏色及氣味；將油田措施廢液殘渣樣品自然風干后置于110 ℃烘箱中烘干至恒重，瑪瑙研缽磨碎，過80目篩，測定其基本理化性質，方法見表1。

表1 樣品基本理化性質測定方法

1.2.2 混合菌液的制備

挑取J2、J4、J5和Ba-6 4株菌單菌落分別接種于100 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，35 ℃、160 r/min條件下振蕩培養24 h，制備菌懸液(600 nm的吸光度(OD600)= 0.5)。將4種菌懸液按照前期實驗確定的最佳接種比例(1.50∶0.50∶0.75∶1.50，質量比)配制成混合菌液。

1.2.3 固定化菌劑的制備

采用吸附法制備固定化菌劑[15]342。分別以麩皮和麩皮炭為固定化載體，準確稱取3.0 g載體添加到100 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后接入20 mL混合菌液，35 ℃、160 r/min條件下振蕩固定24 h。固定結束后于4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌沉淀物后離心，重復洗滌2～3次，離心所得沉淀物即為麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑，室溫下干燥保存備用。

1.2.4 液體環境原油降解實驗

設計3組實驗，分別為：

(1) 稱取以麩皮和麩皮炭制備的固定化菌劑各3.0 g分別加入到100 mL原油降解培養基中。

(2) 稱取已滅菌麩皮和麩皮炭各3.0 g分別與20 mL混合菌液混勻，制成載體與混合菌液的簡單混合物，分別加入到100 mL原油降解培養基中。

(3) 取20 mL混合菌液加入到100 mL原油降解培養基中。

將上述3組實驗于35 ℃、160 r/min條件下振蕩培養5 d，采用紅外測油儀(OIL460)檢測含油率[16]，計算原油降解率。

1.2.5 固定化條件優化

以麩皮、麩皮炭為固定化載體，改變載體添加量(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g)、固定化溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)、固定化時間(12、18、24、30、36、40 h)等條件制備固定化菌劑，當改變其中某個條件時，其他操作同1.2.3節。取兩種固定化菌劑各3.0 g分別接入100 mL 原油降解培養基中，35 ℃、160 r/min振蕩培養5 d，測定含油率，對比降解效果。

1.2.6 固定化菌劑對油田措施廢液殘渣的處理實驗

稱取兩組100 g油田措施廢液殘渣樣品于24 cm×17 cm×7 cm(長×寬×高)規格的塑料盒中，一組添加質量分數5%的麩皮固定化菌劑，另一組添加質量分數5%的麩皮炭固定化菌劑，混合均勻，置于35 ℃培養箱中，期間翻動土壤保持通氧量，定期噴灑無菌水使含水率保持在20%～30%[17]，以不添加任何菌劑的油田措施廢液殘渣為空白對照組，每7天取一次樣，測定含油率。

采用氯代三苯基四氮唑(TTC)-分光光度法測定脫氫酶活性[18]。采用平板計數法[19]測定微生物總數。

1.2.7 油田措施廢液殘渣處理前后原油組分分析

采用氣相色譜(GC)—質譜(MS)分析油田措施廢液殘渣處理前后原油組分的變化。

烷烴參數設定：HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度300 ℃，進樣量1 μL，不分流進樣，載氣流量1 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持5 min；以20 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。

多環芳烴參數設定：HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度300 ℃，進樣量1 μL，不分流進樣，載氣流量1.2 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至300 ℃。

2 結果與討論

2.1 樣品基本理化性質

檢測處理后樣品各項基本理化指標，結果見表2。

表2 油田措施廢液殘渣與潔凈土壤基本理化性質

通過觀察發現，油田措施廢液殘渣樣品呈黑色黏狀固態，帶有惡臭氣味，讓人明顯感覺不適，與潔凈土壤差異明顯，原因是殘渣中含有原油成分及一些厭氧發酵沉渣，使得殘渣外觀屬性發生變化。由表2可知，油田措施廢液殘渣偏弱堿性，含水率適中，較高的含油率導致有機質含量偏高。

2.2 液體環境下原油降解效果評價

按照1.2.4節中的實驗安排，分別開展了以麩皮、麩皮炭制備的兩種固定化菌劑，混合菌液，以麩皮、麩皮炭與混合菌液制成的兩種簡單混合物對原油的降解實驗研究，結果見圖1。

圖1 固定化菌劑、混合菌液及載體與混合菌液的簡單混合物對原油的降解效果Fig.1 Degradation effects of crude oil by immobilized bacteria,mixed bacterial liquid and carrier-mixed bacterial liquid

由圖1可知，麩皮和麩皮炭制備的兩種固定化菌劑對原油的降解效果優于混合菌液，也優于兩種載體與混合菌液的簡單混合物。麩皮炭固定化菌劑對原油的降解率最高，達到91.65%，相比混合菌液降解率提高了38.07%，其次是麩皮固定化菌劑，降解率達85.82%，相比混合菌液提高了29.29%。這是由于固定化菌劑中含有大量原油降解微生物，且載體能夠吸附原油，將原油有效分散，有助于微生物對原油的高效利用。麩皮炭的表面粗糙，更有利于吸附菌體[15]341,[20]，因此其固定化菌劑對原油的降解效果優于麩皮固定化菌劑。載體與混合菌液的簡單混合物中游離菌偏多，載體吸附大量原油時，不利于游離菌對原油的利用[12]2710。

2.3 載體添加量對原油降解率的影響

制備固定化菌劑時，載體的添加量影響微生物負載量，從而影響固定化菌劑對原油的降解效果。載體添加量對原油降解效果的影響見圖2。

圖2 載體添加量對原油降解率的影響Fig.2 The effect of carrier addition on crude oil degradation rate

由圖2可知，麩皮炭固定化菌劑的原油降解率均高于麩皮固定化菌劑，載體添加量為4.0 g時，麩皮炭固定化菌劑與麩皮固定化菌劑的原油降解率達到最大，分別為94.02%、90.68%，當添加量低于或高于4.0 g時，兩種固定化菌劑的原油降解率均減小。載體添加量較少時，載體吸附微生物的比表面積小，單位質量的載體附著的微生物密度過大，種群之間會爭奪營養物質，阻礙菌體進一步生長繁殖，對降解效果不利；當載體添加量不斷增加，單位質量載體吸附的微生物數量減少，難以保證降解菌體數量充足，導致降解能力下降。因此，制備麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑的載體最佳添加量為4.0 g。

2.4 固定化時間對原油降解率的影響

固定化菌劑制備過程中，固定化時間會影響微生物吸附效果，進而對固定化菌劑的原油降解性能產生影響。采用不同固定化時間制備的固定化菌劑對原油降解效果的影響見圖3。

圖3 不同固定化時間對原油降解率的影響Fig.3 The effect of different immobilization time on crude oil degradation rate

由圖3可知，隨著固定化時間的延長，麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑的原油降解率均呈現先上升后下降的趨勢，當固定化時間為30 h，麩皮固定化菌劑與麩皮炭固定化菌劑的原油降解率達到最高，分別為91.47%和95.29%。固定化時間不足30 h時，微生物難以充分及牢固地吸附在載體上，使得單位質量固定化菌劑中菌體數量較少。當固定化時間超過30 h后，載體對微生物的吸附達到了相對飽和，氧氣和養分的限制及菌體的濃度過高，導致菌體開始衰亡解體，降解活性下降，出現了微生物脫附現象，原油降解率也隨之降低。因此，選擇30 h作為最佳的固定化時間。

2.5 固定化溫度對原油降解率的影響

固定化菌劑對原油的降解主要借助酶催化來完成，而酶活性對溫度敏感，因此溫度對固定化菌劑降解活性至關重要[21]。不同固定化溫度對固定化菌劑的原油降解效果影響見圖4。

圖4 不同固定化溫度對原油降解率的影響Fig.4 The effect of different immobilization temperature on crude oil degradation rate

由圖4可知，隨著固定化溫度的升高，麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑對原油降解率均呈現先升高后下降的趨勢，當固定化溫度為35 ℃時，麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑對原油的降解效果最好，降解率分別為92.32%、95.70%，此時酶活性保持最高，微生物生長代謝旺盛，促進了微生物對原油的利用。當溫度低于或高于35 ℃，原油降解率都處于下降趨勢，這是由于溫度不合適時酶活性低，微生物生長代謝減弱，從而影響固定化菌劑對原油的降解效果。因此制備固定化菌劑的最佳固定化溫度為35 ℃。

2.6 固定化菌劑對油田措施廢液殘渣的處理效果

2.6.1 處理過程中含油率的變化

以不添加任何菌劑的油田措施廢液殘渣為空白對照，以麩皮和麩皮炭制備的兩種固定化菌劑對油田措施廢液殘渣處理過程中含油率的變化見圖5。

圖5 處理過程中含油率的變化Fig.5 The change of oil content during the disposal process

由圖5可知，即使不添加任何菌劑，油田措施廢液殘渣含油率也有一定下降，經過63 d的處理，最終原油降解率為16.18%，這種下降是殘渣中存在的土著微生物對原油產生了一定的降解，以及輕質原油的揮發引起的。

添加了固定化菌劑的兩組處理的含油率出現了顯著下降，且呈現3個階段。第1階段是0～7 d，麩皮固定化菌劑與麩皮炭固定化菌劑的原油降解率增長緩慢，油田措施廢液殘渣處理效果不佳，降解率均未超過5%，原因是降解微生物處于環境適應期，生長緩慢，代謝率低，對原油的利用少；第2階段是7～49 d，微生物逐漸適應環境，碳源等營養物質豐富，微生物迅速生長繁殖，對原油的需求增加，殘渣含油率也迅速降低。49 d測定得麩皮固定化菌劑與麩皮炭固定化菌劑的原油降解率分別為85.38%、89.65%，含油率分別降至1.96%、1.39%；第3階段是49～63 d，營養物質逐漸耗盡，原油中易于降解的烷烴類物質基本被利用，營養物質的缺乏導致微生物生長受到限制，從而使代謝率降低。最終，麩皮固定化菌劑與麩皮炭固定化菌劑的原油降解率趨于平穩。

2.6.2 處理過程中微生物數量的變化

降解微生物的數量可以反映出微生物對環境的適應能力及生長狀況，對處理效果具有重要影響，可以間接表征石油污染物的降解程度。油田措施廢液殘渣在63 d的處理過程中微生物數量的變化見圖6。

由圖6可知，添加了固定化菌劑的兩個處理微生物數量顯著高于空白對照，兩組處理在處理油田措施廢液殘渣過程中微生物數量呈現先增加后減少的趨勢。1～7 d，微生物數量增加緩慢，這是由于此時微生物正處于環境適應期，生長代謝緩慢；7 d后，微生物逐漸適應環境，碳源等營養物質豐富，微生物數量呈指數級增加；當處理至28 d時，麩皮炭固定化菌劑處理的油田措施廢液殘渣中微生物數量達到最大，為1.773×108cfu/g；麩皮固定化菌劑處理的油田措施廢液殘渣微生物數量在處理至35 d時達到最大，為1.456×108cfu/g；處理后期，微生物數量逐漸減少，這是由于碳源等營養物質不斷被消耗，微生物生長受到限制，出現衰亡現象。空白對照在整個處理期間微生物數量變化不大，維持在較低的水平。

圖6 處理過程中微生物數量的變化Fig.6 The change of microbial quantity during the disposal process

2.6.3 處理過程中脫氫酶活性的變化

在油田措施廢液殘渣處理體系中，微生物能夠以原油作為碳源，主要是依靠酶的催化作用。脫氫酶的活性可以間接反映處理體系中微生物的量及其對有機物的降解能力。油田措施廢液殘渣在63 d的處理過程中脫氫酶活性的變化見圖7。

圖7 處理過程中脫氫酶活性的變化Fig.7 The change of dehydrogenase activity during the disposal process

由圖7可知，空白對照的脫氫酶活性變化不大，維持在較低的水平。不同處理中脫氫酶活性呈現出一個動態變化。脫氫酶活性的變化與微生物數量有關。初期，油田措施廢液殘渣中營養豐富，微生物生長繁殖快，脫氫酶活性高；處理至28 d，以麩皮炭固定化菌劑處理的油田措施廢液殘渣中脫氫酶活性達到最高，為59.22 U/g；處理至35 d，麩皮固定化菌劑處理的油田措施廢液殘渣中脫氫酶活性達到最高，為52.48 U/g；后期，脫氫酶活性下降，是由于在處理過程中隨著碳源等營養物質的不斷減少，微生物數量減少。

2.6.4 處理過程中原油組分的變化

為探討兩種固定化菌劑對原油不同組分的降解規律，分析了油田措施廢液殘渣在處理前后烷烴及多環芳烴含量變化，結果見圖8和圖9。

圖8 處理前后烷烴質量分數的變化Fig.8 The change of alkane mass fraction before and after disposal

圖9 處理前后多環芳烴質量分數的變化Fig.9 The change of polycyclic aromatic hydrocarbon mass fraction before and after disposal

由圖8可知，與空白對照相比，麩皮固定化菌劑與麩皮炭固定化菌劑對油田措施廢液殘渣中烷烴的降解效果明顯。殘渣中的烷烴主要為C13～C31，C13以下的烷烴易揮發，不易直接檢測到。其中C17～C27質量分數占總烷烴的75%以上。根據其物理性質劃分標準，C17及以下為低碳烷烴，C17以上為高碳烷烴。由圖8可見，油田措施廢液殘渣樣品中的烷烴以高碳烷烴為主。經麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑處理后，烷烴的質量分數大幅度下降，其中C13、C14烷烴被完全降解，低碳烷烴降解率分別達95.35%和96.16%，高碳烷烴降解率分別達82.52%和86.24%，這表明兩種固定化菌劑對油田措施廢液殘渣中不同碳鏈組分均能有效降解，顯示出較大的碳鏈利用范圍。

綜上可知，采用麩皮和麩皮炭制成的固定化菌劑對油田措施廢液殘渣具有良好的處理能力，麩皮和麩皮炭為載體的固定化菌劑在63 d的處理周期內，原油降解率分別可達85.38%、89.65%。

3 結 論

(1) 液體環境中，麩皮炭固定化菌劑的原油降解率為91.65%，麩皮固定化菌的原油降解率為85.82%，與未固定化的混合菌液相比，原油降解率均提高30%左右。

(2) 以麩皮和麩皮炭為載體制備固定化菌劑的最佳條件為：載體添加量4.0 g，固定化時間30 h，固定化溫度35 ℃。優化后的麩皮固定化菌劑和麩皮炭固定化菌劑的原油降解率分別可達92.32%、95.70%。

(3) 為期63 d的固定化菌劑對油田措施廢液殘渣處理過程中，含油率在7～49 d快速下降，之后基本不再降低，麩皮炭固定化菌劑的原油降解率可達89.65%，麩皮固定化菌劑的原油降解率可達85.38%，且兩種固定化菌劑均能有效降解不同鏈長烷烴及不同環數多環芳烴，顯示出較大的石油烴利用范圍。