擬南芥XTH33 基因的CRISPR/Cas9高效敲除質粒構建

王大鵬，孔麗娜，黃 姍，閆金國

（濰坊護理職業學院醫學基礎部，山東 青州 262500）

近年來的研究成果深化了我們對于木葡聚糖生物合成、重排及降解的酶學認識。研究發現木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH）為多基因家族編碼的一類蛋白質，屬于糖苷水解酶家族GH16。其對植物根莖葉的形態建成、木質部的形成中發揮重要作用，并能影響植株果實發育，增強植株抗逆性。

人工改造過的Cas9/gRNA 系統通過gRNA 引導Cas9 蛋白識別并剪切帶有gRNA 靶點的雙鏈DNA，用于基因敲除和精確編輯DNA 等操作。CRISPR 技術進行基因敲除和編輯操作的第一步，需要獲得剪切活性高的gRNA 靶點。Cas9/gRNA 剪切活性是由gRNA 靶點的識別序列決定的，每個gRNA 的剪切活性都會不同。本研究經體外gRNA 活性檢測，選取高效靶點，成功構建擬南芥XTH33 基因敲除質粒，并將敲除質粒轉入農桿菌GV3101，為進一步進行XTH33 基因功能鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

gRNA 靶點效率檢測試劑和pUbi-atU6-gRNA 質粒骨架均由北京唯尚立德生物科技有限公司購買，DH5α 感受態細胞、Loading Buffer、DNAmarker、T4 磷酸化酶（T4PNK）、質粒純化試劑盒、PBS 緩沖液、成品LB 培養基粉末、瓊脂糖粉、農桿菌GV3101、T4連接酶、引物合成及測序由博邁德生物科技有限公司完成。

1.2 XTH33 基因的gRNA 設計與合成

首先應用在線工具（http：//crispr.mit.edu）設計出符合實驗要求的gRNA，gRNA 設計的主要原則[2]：必須選擇在靠前的外顯子區域；3’端要20 個連續的堿基序列，有NGG 堿基序列但不包括PAM 序列；并用生物信息學軟件對擬南芥進行全基因組比對，盡量降低脫靶風險，以防Cas9 無法工作，需避免染色體和核小體三維結構造成的空間位阻效應，設計完成后合成引物gRNA-G1-FP1、gRNA-G2-FP2、gRNA-G3-FP3、gRNA-RP。

1.3 體外gRNA 靶點活性檢測

四 條 引 物gRNA-G1-FPg1、gRNA-G2-FPg2、gRNA-G3-FPg3、gRNA-RP，分別使用T7-gRNA-FPg（1-3）和gRNA-RP 引物對，以標準gRNA 模板為模板做PCR，對于每個樣品50μL 體系擴增2 管，檢測正確后使用PCR 產物純化試劑盒進行過柱純化操作，最后使用40μ LDEPC H2O 洗脫DNA，測濃度（至少要≥70ng/μL）作為后續體外轉錄的DNA 模板。同時準備標準gRNA1（g1）和標準gRNA2（g2）的PCR 產物。酶切DNA 的準備：將gRNA 靶點（包括PAM 序列）通過搭橋PCR 的方式構建到PCR 產物中，回收備用。gRNA 的轉錄：10×Transcription Buffer 2μL、rNTPT7 2μL、RNA Polymerase Mix 2μL、gRNA PCR 產物（上一步產物）1μg、DEPC H2O up to 20μL，以上混合后，37℃反應2H，反應結束后，加入2μL DNase I，37℃反應30min，并對gRNA 進行回 收 與 提 取。Cas9/gRNA 體 外 酶 切：spCas9 1μL、10XspCas9 buffer 2μL、gRNA（體外轉錄）50ng、酶切的dsDNA 50ng、ddH2O up to 20μL，充分混合后，37℃反應30min，加入3μL DNA Loading Buffer 混合后65℃煮5min，跑2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對比與兩個對照gRNA 估算活性。

1.4 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質粒的構建及鑒定

反應體系：XTH-G3-Sense 5μL、XTH-G3-Anti 5μL、ddH2O 15μL 混勻后，95℃3min，95℃到25℃緩慢冷卻，并16℃5min。第一步 的 產 物1μL、Cas9/gRNAVector 1μL、Solution 1μL、Solution2 1μL、H2O 6μL 混勻后16℃反應2h。取第二步產物5～10μL 加入到剛解凍的50μLDH5a 感受態細胞中，混勻，冰浴30min 后，42℃熱激90s，冰上靜置2min，然后加入500μL 無抗LB，置于37℃恒溫搖床中，170 轉，復蘇1h 后涂卡納抗性的平板，培養過夜，挑取單菌落搖菌，并提取質粒，直接進行基因測序鑒定。鑒定正確的質粒與農桿菌GV3101 感受態一管，混合后冰浴10min。然后置于液氮中8min，隨后37℃水浴5min。從水浴鍋中取出后冰浴2～3min，加入800μl 無抗生素的YEB 液體培養基，28℃180rpm 搖床上培養4h 左右，取出500μl 菌液，均勻地涂布于加50mg/L Kan和50mg/L Rif 的YEB 瓊脂培養基上，28℃培養出單菌落，并進行PCR 鑒定。

2 結果

2.1 體外gRNA 靶點活性檢測

體外gRNA 靶點活性檢測結果見圖1，凝膠電泳結果顯示G3 靶點活性明顯大于標準品一的酶切效率，在50%以上，表明G3 靶點活性良好，可以使用。

圖1 體外gRNA 活性檢測結果

2.2 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質粒構建結果

挑取2 個白色菌落搖菌，提質粒進行測序鑒定，測序比對結果見圖2。結果顯示靶點序列全部插入正確，XTH33 敲除質粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33 構建成功。

圖2 質粒測序比對結果

2.3 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質粒轉入農桿菌

質粒轉入農桿菌感受態GV3101 后，28℃培養24h，出單菌落，挑取6 個單菌落，用引物XTH-G3-Sense：TTGGTCGAGAGTGAGCTTAGCGAGGG，pUbi-atU6-RP：GATGAAGTGGACGGAAG GAAGGAG 進行PCR 鑒定。結果顯示1、2 號菌落批出430bp 的目的條帶，鑒定正確。成功將pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質粒轉入農桿菌GV3101，鑒定結果見圖3。

圖3 農桿菌菌液PCR 鑒定結果

3 討論

CRISPR 系統是由Cas 基因和成簇間隔的短回文重復序列組成。其原理是gRNA 序列可以靶向識別可以堿基互補的DNA 序列，并在Cas9 蛋白作用下特異性地切割其靶序列[2]。與傳統的siRNA 和shRNA 基因沉默技術相比，CRISPR/Cas9 技術直接在基因水平進行操作，改變基因組成，使基因沉默效果更加徹底，而且CRISPR/Cas9 敲除質粒構建更為簡單和高效，對于同物種不同基因，只需要設計不同基因的gRNA 序列，并插入載體骨架即可，但Cas9/gRNA 剪切活性與gRNA 靶點的識別序列有關，gRNA 的活性高低直接影響基因剪切效率。因此，靈活高效地選取高活性的gRNA，是進行敲除質粒構建并進一步實現基因編輯的關鍵。

CRISPR/Cas9 系統的載體構建中，為了方便高效的選取高活性gRNA 序列，提高基因敲除成功率，實驗中首先設計3 條靶向擬南芥XTH33 基因的gRNA，通過體外檢測手段檢測3 條gRNA活性，選取活性最高的靶點XTH33-G3，靶點活性在50%以上，用活性最高的G3 靶點構建敲除質粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33。通過體外gRNA 活性活性檢測，可以初步判定gRNA 的效率，以便得到高效的敲除質粒，此方法省時省力，加快了實驗進度，減少了試錯機會，可以節省不必要的費用，并提高了基因敲除成功率。

本實驗，成功進行了體外gRNA 活性檢測，并構建XTH33 基因的CRISPR/Cas9 高效敲除質粒，為以后高效選取gRNA 提供了借鑒，并為下一步進行XTH33 基因功能鑒定奠定基礎。