丁酸鈉對CHO細胞生長及rhEPO表達量的影響

＊吳春凱 王沖 孫國振 李良霄 袁考哲

（濱州醫學院 山東 264003）

據查詢國外研究資料顯示，1987年至1989年期間，生物醫學研究者在培養器皿中培養上皮細胞生產t-PA時，通過添加不同濃度的丁酸鈉，獲得不同產率的t-PA，但是濃度的添加存在一定閾值。之后，生物醫學研究者在研究丁酸鈉處理重組CHO細胞生長時，得出丁酸鈉的存在可以提高腺病毒晚期啟動子與重組Ⅷ因子mRNA的轉錄。通過丁酸鈉濃度的含量減慢細胞培養分裂的周期，提高細胞分泌的產物。重組CHO細胞的產物紅細胞生成素（rhEPO），而且在糖末端連接一定的唾液酸，該物質的含量程度能夠提高rhEPO的活性因數[1]。rhEPO的普遍應用在臨床上治療腎性貧血類疾病與惡性腫瘤貧血類疾病，而且促紅細胞生成素的產生目前階段僅通過重組CHO細胞表達。故此，研究重組CHO細胞與rhEPO表達量的重要性不言而喻。

現階段，丁酸鹽類物質通常在腸道內形成，并存儲于動物的脂肪之中。雖然丁酸鹽在動物體內的濃度不高，但是其擁有的生物學活性卻不容小覷。例如，在動物細胞培養階段，通過加入一定含量的丁酸鹽或丁酸鈉，將會為細胞的培養帶來不可思議的可逆形態變化。部分生理變化由內部基因的表達和細胞生長發育的調節機理所決定。根據臨床細胞的培養，丁酸鈉能夠借助自身性質同時激活多種途徑誘發細胞G1期阻滯，比如抑制組蛋白去乙酰化酶的基本活性因數、蛋白激酶抑制蛋白活性因數等。前面提及到在細胞培養階段，通過添加適量的丁酸鈉可以有效提高重組CHO細胞生長與rhEPO表達水平，同時因丁酸鈉對細胞生長繁殖的抑制作用是可逆的，也就是意味著撤去丁酸鈉物質時，細胞的活性又會與早期階段表達水平一致[2]。基于以上對丁酸鈉和rhEPO表達的描述，本文通過對照實驗的研究方式，培養重組CHO細胞生長，并采用不同濃度的丁酸鈉作出處理，以此檢測rhEPO表達水平，目的在于探究丁酸鈉在工程細胞株的活性影響，繼而得出提升重組CHO細胞產物rhEPO表達水平的方案，為后續的大規模臨床研究奠定基礎，現以丁酸鈉對CHO細胞生長及rhEPO表達量的實驗回顧性分析如下。

1.材料與方法

(1)實驗材料

本次研究過程的實驗材料選擇為：①重組蛋白CHO細胞是由本實驗室構建與保存；②能夠培養細胞的血清培養皿DMEM/F12是購置于國外的Hyclone公司；③需要添加的10%胎牛血清是購置于國外的一家Bioind（BI）公司，胰酶是購置于國外的一家Gibco公司；④無血清培養基選定為SFM。

(2)細胞培養

表達rhEPO的重組蛋白CHO細胞在培養階段，需采用24孔板培養，并保證研究組與對照組的細胞接種數含量一致，即每個孔板接種60000個細胞數目。同時，研究組與對照組的重組蛋白CHO細胞需放置于37℃、5%二氧化碳濃度以及適宜的濕度環境下作出精密培養。兩組細胞培養首先使用添加了含有10%的血清培養皿DMEM進行培養，之后等到細胞培育鋪滿后，依次獲取上層培養液。對照組細胞培養時需使用SFM無血清培養皿進行培養，而研究組細胞需將SFM無血清培養皿更換為含有0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L的丁酸鈉濃度的培養皿，每一個丁酸鈉濃度設置三個復孔位，其他條件應該嚴格保持一致。整個細胞的培養過程中，需要注意隔一天換一次培養液，繼續收集培養液的上層清液，同時使用血球計數板計數細胞密度，計算出相應的細胞生長曲線以及使用6塊24孔板，保持實驗周期在20天。另外，實驗細胞樣本的存放需要放置于-80℃的環境中，并用于促紅細胞生成素表達水平的檢測[3]。

(3)檢測方法

①細胞計數。細胞計數需借助專業儀器，即血球計數板或者CASY細胞計數儀設備，以此保證細胞計數的準確性，同時使用臺盼藍拒染法測定細胞的存活率。

②細胞純化與純度檢測。細胞計數后需要作出純化處理，即采用國外某公司的PF設備，將每一次收起的培養液上層清液進行三次純化操作（親和環節、離子交換環節、凝膠過濾環節）。完成了細胞純化操作步驟后，需要在SDS-PAGE電泳設備的幫助下，檢測樣本的純度數據，即濃縮膠的濃度系數維持在4.5%左右，分離膠的濃度系數維持在12.5%左右[4]。

③細胞表達量的測定。在重組蛋白CHO的rhEPO表達量的測定上，可以借助目前較為先進的DOTBLOT測定方法，該測定方法在前人的基礎上作出相應的改進，將純化后的洗脫液含量提取5μL放置于雜交膜上，并采用偶聯有辣根過氧化物酶抗EPO抗體作為一抗，繼而執行DOTBLOT檢測方案。經過顯影曝光測定過程，以標準品陽性信號的強弱梯度作為測定標準，以此計算出樣品中rhEPO表達量的水平。除此之外，在唾液酸含量的檢測上需借助間苯二酚法予以測定[5]。

2.結果

（1）分析丁酸鈉的添加含量對重組CHO細胞生長的影響。據實驗結果顯示，細胞計數與細胞存活量數據，丁酸鈉的添加含量在對重組蛋白CHO細胞的抑制作用效果越強。根據實驗數據顯示，丁酸鈉的添加含量對重組CHO細胞生長的形態存在一定的影響，比如對照組細胞的形狀呈現出一種多層次的生長狀態，且大部門的細胞以圓形為主；研究組細胞的形狀呈現出一種簇狀的生長趨勢，且培養濃度越高的培養皿內細胞簇越小，以長梭狀為主。丁酸鈉的添加含量對重組CHO細胞生長的影響，見圖1所示。

圖1 丁酸鈉的添加含量對重組CHO細胞生長的影響

（2）分析丁酸鈉的添加含量對產物細胞rhEPO表達的影響。據實現數據顯示，在0.25mmol/L至0.5mmol/L的丁酸鈉濃度范圍內，丁酸鈉的濃度高低決定了重組蛋白CHO細胞產物rhEPO表達的水平，且丁酸鈉濃度越高rhEPO表達的水平則越高，同時伴隨著培養時間的延續，單位時間內的單位細胞rhEPO表達水平呈現上升的趨勢，與濃度的高低存在正比例關系。

（3）分析丁酸鈉的添加含量對葡萄糖代謝的影響。據實驗研究數據顯示，丁酸鈉的添加能夠對重組蛋白CHO細胞的糖代謝產生抑制作用，且與濃度含量多少的存在一定影響。在加入丁酸鈉后，研究組重組CHO細胞的平均比葡萄糖損耗速率與對照組的8×10-9mmol/L降低至6×10-9mmol/L。造成此類影響的原因在于葡萄糖進入細胞后的代謝途徑相關。在對照組重組CHO細胞的培養階段，因不含有丁酸鈉物質，細胞會處于不斷生長與分裂過程中，葡萄糖物質的應用除了供細胞自身所需以及rhEPO表達量之外，還用于細胞物質的大量合成。丁酸鈉的添加含量對葡萄糖代謝的影響，見圖2所示。

圖2 丁酸鈉的添加含量對葡萄糖代謝的影響

（4）分析丁酸鈉的添加含量對重組CHO細胞表達量的影響。據實驗研究數據顯示，研究組細胞在培養時間的延長后其rhEPO表達量呈現增長的趨勢，對照組細胞的rhEPO表達量在一定培養時間過程呈現降低趨勢。0.25mmol/L的丁酸鈉濃度在添加的第四天后，其rhEPO表達量便已經超過對照組的細胞rhEPO表達量。隨著丁酸鈉濃度的逐漸提高，對CHO細胞的抑制作用越來越強，以至于rhEPO表達量經過一段時間后才會超過對照組rhEPO表達量。故此，通過0.25mmol/L與0.5mmol/L的丁酸鈉濃度的添加，獲取的rhEPO表達量分別提升了36%與25.8%。另外，隨著培養的時間逐漸延長，產生的rhEPO表達量則會越高。

3.討論

據本次研究報告指出，研究組重組蛋白CHO細胞的培養階段，添加不同濃度的丁酸鈉，可以有效的抑制細胞的生長，但對于短期內的rhEPO表達水平提升效果不佳。故此，在細胞的生長周期中如若獲取rhEPO表達量可以在培養的中后期添加一定含量的丁酸鈉濃度，適當的延長細胞的生長周期，以便得到更多的rhEPO表達量。另外，丁酸鈉的添加可能會影響蛋白糖基化，導致唾液酸含量和寡糖鏈位點占有率降低，此處的研究還需進一步驗證。希望本文在丁酸鈉對CHO細胞生長及rhEPO表達量影響的研究，可以為同領域的學者提供借鑒價值。