高效液相色譜法測(cè)定利巴韋林滴眼液中有關(guān)物質(zhì)的含量

馮文，劉峰，謝華（四川省藥品檢驗(yàn)研究院，成都 611731）

利巴韋林（ribavirin）又名病毒唑、三氮唑核苷等，化學(xué)名為1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-羧酰胺（結(jié)構(gòu)式見圖1），是廣譜強(qiáng)效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物[1-2]，屬合成核苷類藥，對(duì)多種DNA 和RNA 病毒有抑制作用，具有作用位點(diǎn)多、不易產(chǎn)生耐藥性、療效高、毒性低和不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，現(xiàn)已用于多種病毒的治療。

有關(guān)物質(zhì)的考察貫穿于整個(gè)藥品研究，直接關(guān)系到制劑質(zhì)量的可控性與安全性。利巴韋林滴眼液的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法未見報(bào)道，國(guó)內(nèi)外藥典雖收載其原料藥的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法[3-6]，但由于滴眼液中抑菌劑等特殊輔料[7]（如羥苯乙酯）與利巴韋林極性差異較大，利巴韋林原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法無(wú)法及時(shí)將其洗脫，連續(xù)進(jìn)樣多針后殘留物將干擾后續(xù)樣品的測(cè)定。因此，本文建立了一種測(cè)定利巴韋林滴眼液中主要降解雜質(zhì)A（結(jié)構(gòu)式見圖1）及其他有關(guān)物質(zhì)的方法，以消除滴眼液中特殊輔料的干擾，為其質(zhì)量提供了可靠的檢測(cè)依據(jù)，也為本品研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量提升提供分析方法。

圖1 利巴韋林雜質(zhì)A 與利巴韋林化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure formula of impurity A and ribavirin

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Agilent 1100（安捷倫科技有限公司）；高效液相色譜儀島津LC20A（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司）；電子天平（賽多利斯Sartorius CPA255D，十萬(wàn)分之一）。

利巴韋林滴眼液[A 企業(yè)3 批次；B 企業(yè)15批次；C 企業(yè)2 批次；D 企業(yè)2 批次；E 企業(yè)6 批次；F 企業(yè)15 批次；G 企業(yè)14 批次；H 企業(yè)5 批次；I 企業(yè)3 批次；J 企業(yè)14 批次；K 企業(yè)17 批次（其中批號(hào)為20010401 樣品用于方法學(xué)驗(yàn)證）]。利巴韋林對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140629-201703，含量：99.60%），利巴韋林雜質(zhì)A（TLC，批號(hào)：3793-019A1，含量：100%），空白輔料由各企業(yè)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品適量，用水稀釋制成每1 mL 中約含利巴韋林0.5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱取利巴韋林對(duì)照品與雜質(zhì)A 對(duì)照品各約10 mg，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得利巴韋林對(duì)照品儲(chǔ)備液與雜質(zhì)A 對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密量取利巴韋林對(duì)照品儲(chǔ)備液與雜質(zhì)A 對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.5 mL，置同一100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 對(duì)照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性溶液 取供試品溶液5 mL，加入1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液5 mL，靜置30 min，用5 mL 1 mol·L－1的鹽酸溶液中和，以產(chǎn)生雜質(zhì)A 溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.1.6 空白輔料溶液配制 由于各企業(yè)處方不同，空白輔料溶液是11 家企業(yè)所用所有輔料的混合溶液。即精密稱取氯化鈉0.9 g、硼酸0.95 g、硼砂50 mg、羥苯乙酯40 mg、苯扎溴銨10 mg、甘油1.0 g 置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL 置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱Waters Atlantis T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%硫酸鈉水溶液（取無(wú)水硫酸鈉1.0 g，加水950 mL 溶解，加2 mL5%磷酸，用5%磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8，用水稀釋至1000 mL，即得）為流動(dòng)相A，以乙腈-流動(dòng)相A（5∶95）為流動(dòng)相B，以20%乙腈為流動(dòng)相C，以乙腈為流動(dòng)相D；流速為1.0 mL·min－1；按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣體積為20 μL。系統(tǒng)適用性溶液中，雜質(zhì)A（相對(duì)保留時(shí)間約0.78）與利巴韋林分離度應(yīng)不低于4.0。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.3 專屬性考察

精密量取空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液各20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖2）。空白輔料對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定無(wú)干擾，各雜質(zhì)與主成分分離良好，方法專屬性良好。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of system suitability solution

2.4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

為考察在所選擇的色譜條件下能否檢出利巴韋林滴眼液中可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，分別用高溫、酸、堿、氧化和光照等劇烈條件對(duì)本品進(jìn)行破壞，試驗(yàn)如下：

① 未破壞溶液：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

② 酸破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，靜置120 min，用等濃度氫氧化鈉溶液中和，加水稀釋至刻度作為酸破壞溶液；同法配制酸空白溶液及酸破壞輔料溶液。

③ 堿破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，靜置60 min，用等濃度鹽酸溶液中和，加水稀釋至刻度作為堿破壞溶液；同法配制堿空白溶液及輔料溶液。

④ 高溫破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，密封，于105℃加熱8 h 作為高溫破壞溶液；同法配制高溫輔料溶液。

⑤ 光照破壞：取本品適量，5000 Lx 光照射5 d，取破壞后樣品5 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；同法配制光照輔料溶液。

⑥ 氧化破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加入30%過(guò)氧化氫溶液2.0 mL，靜置60 min，用水稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液；同法配制氧化空白溶液及輔料溶液。

取上述溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，結(jié)果見圖3。由強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果可知，本品在光照條件下相對(duì)比較穩(wěn)定；在酸、堿和高溫條件下主要破壞產(chǎn)生雜質(zhì)A，其中在堿性條件下破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)A 最多；在氧化條件下破壞出雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)最多，保留時(shí)間約為5.5 min 和17 min 的雜質(zhì)有明顯增加。破壞試驗(yàn)中各雜質(zhì)峰與利巴韋林峰分離良好，無(wú)其他雜質(zhì)峰干擾已知雜質(zhì)的測(cè)定，能有效檢出雜質(zhì)，表明該色譜方法專屬性良好。

圖3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of forced degradation test

2.5 線性試驗(yàn)

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用水稀釋制成含利巴韋林和雜質(zhì)A 的質(zhì)量濃度分別約為0.25、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的系列濃度的對(duì)照品溶液。精密量取系列濃度的對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 利巴韋林和雜質(zhì)A 的回歸方程、范圍、檢測(cè)限和定量限Tab 2 Linearity，regression equation，LOQ and LOD of ribavirin and impurity A

2.6 檢測(cè)限、定量限

將線性溶液（15 μg·mL－1）逐步稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3∶1 確定檢測(cè)限，S/N為10∶1 確定定量限，結(jié)果見表2。

2.7 進(jìn)樣精密度

精密吸取對(duì)照品溶液與對(duì)照溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定6 次，記錄色譜圖，考察進(jìn)樣精密度，結(jié)果利巴韋林與雜質(zhì)A 連續(xù)6針峰面積RSD分別為0.3%和0.4%，表明本法進(jìn)樣精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性

精密吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照溶液與供試品溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在常溫下于0、2、4、6、10、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果主成分及雜質(zhì)A 峰面積RSD均小于2%，也無(wú)其他雜質(zhì)產(chǎn)生，表明各溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 準(zhǔn)確度

按照各企業(yè)提供的處方及輔料對(duì)試藥進(jìn)行混合，得到多組分多廠家共用空白輔料，添加相應(yīng)的利巴韋林對(duì)照品（雜質(zhì)均未檢出），作為陰性樣品，稱取陰性樣品適量（約相當(dāng)于利巴韋林5 mg），共9 份，分別置10 mL 量瓶中，再分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加流動(dòng)相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為準(zhǔn)確度試驗(yàn)80%、100%、120%的供試品溶液，按照擬訂的色譜條件檢測(cè)。結(jié)果雜質(zhì)A 的回收率在94.6%～100.3%，RSD均＜2.0%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.10 重復(fù)性

精密量取本品適量，用水定量稀釋制成每1 mL 中約含利巴韋林0.5 mg 的溶液，作為供試品溶液，平行制備6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，已知雜質(zhì)A 按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，未知雜質(zhì)按自身對(duì)照法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果顯示，雜質(zhì)A的RSD為4.1%，最大未知單雜RSD為3.3%，總雜RSD為4.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.11 雜質(zhì)校正因子

在兩臺(tái)液相色譜儀（Agilent 1100 高效液相色譜儀和島津LC20A 高效液相色譜儀）上，考察3 根色譜柱[型號(hào)分別為：Waters Atlantis T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry Shield C18（4.6 mm×150 mm 5 μm）、YMC-Triart C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）]，分別進(jìn)樣“2.5”項(xiàng)下線性溶液，以各成分進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，用利巴韋林斜率除以雜質(zhì)A 斜率測(cè)得雜質(zhì)A 相對(duì)校正因子的平均值為2.0，為雜質(zhì)A 的準(zhǔn)確定量提供了經(jīng)濟(jì)便捷的計(jì)算方式。

2.12 耐用性

為考察本方法對(duì)條件發(fā)生微小變化的耐受程度，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，改變因素包括流動(dòng)相比例±2%、流速變化±10%、柱溫變化±10%。以含有3 種已知雜質(zhì)A 的樣品（D 企業(yè)，批號(hào)20010401）為耐用性試驗(yàn)溶液，考察條件改變對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。經(jīng)測(cè)定，在上述各條件下雜質(zhì)A 與主成分之間分離度良好，測(cè)得雜質(zhì)A 的RSD分別為3.4%，最大未知單雜RSD為4.5%，總雜RSD為3.3%，表明方法耐用性良好。

2.13 樣品測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定11 個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)共96 批利巴韋林滴眼液中的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表3。

表3 利巴韋林滴眼液有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Tab 3 Determination of related compounds in ribavirin eyes drops

2.14 限度

參照《中國(guó)藥典》2020年版利巴韋林原料及其注射液的限度，同時(shí)考慮本品的臨床使用情況，擬定有關(guān)物質(zhì)限度為：供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，除輔料峰外，雜質(zhì)A 按校正后的峰面積計(jì)算（乘以校正因子2.0）不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5 倍（0.5%）；其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5 倍；各雜質(zhì)校正后峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積（1.0%）。

2.15 未知雜質(zhì)的定性研究

K 企業(yè)17 批樣品均合格，其中最大未知單雜均為相對(duì)保留時(shí)間約1.9 的雜質(zhì)，檢出量為利巴韋林標(biāo)示量的0.32%～0.44%，其他10 家生產(chǎn)企業(yè)樣品中未檢出該雜質(zhì)。采用2D-HPLC-DADESI-Q-TOF 技術(shù)[一維液相條件同本文建立的色譜條件；二維液相條件為：采用中心切割，色譜柱為Agilent EclipsePlus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～17.6 min，95%A；17.6～23 min，95%→5%A；23～35 min，5%A），流速為0.3 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；質(zhì)譜條件為：采用ESI 源，質(zhì)譜掃描范圍為100～1000m/z，負(fù)離子模式，Gas Temp：325℃，Drying Gas：8 L·min－1，VCap：3500 V，Expt：1000 V]。推測(cè)降解反應(yīng)機(jī)制，將K 企業(yè)樣品（批號(hào)：20010401）105℃加熱8 h 進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 未知雜質(zhì)（相對(duì)保留時(shí)間約1.9）的一維液相色譜圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig 4 One-dimensional liquid chromatogram（A）and MS1（B）of unknown impurity（relative retention time about 1.9）

根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，相對(duì)保留時(shí)間約為1.9 的雜質(zhì)m/z為200.9832[M-H]－，推測(cè)其為硫柳汞鈉與氯化鈉配伍所產(chǎn)生[8-10]，反應(yīng)機(jī)制為：硫柳汞鈉在氯化鈉存在的條件下，可分解為硫代水楊酸和氯化乙基汞，硫代水楊酸不能穩(wěn)定存在，經(jīng)氧化生成較為穩(wěn)定的2，2'-二硫代二苯甲酸。2，2'-二硫代二苯甲酸在乙基汞的作用下，部分分解轉(zhuǎn)化為硫柳汞鈉，部分經(jīng)三步氧化，最終轉(zhuǎn)化為2-磺基苯甲酸（見圖5）。

圖5 2-磺基苯甲酸生成機(jī)制圖Fig 5 Formation mechanism of 2-sulfobenzoic acid

3 討論

3.1 色譜條件篩選

采用利巴韋林的堿破壞溶液，分別參照ChP2020、BP2020 中利巴韋林有關(guān)物質(zhì)檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。ChP2020 采用氫型陽(yáng)離子交換柱，在該色譜條件下主峰出峰較快，峰形較差，與相鄰雜質(zhì)峰分離度不佳，且由于該類色譜柱與有機(jī)溶劑不能耐受，無(wú)法洗脫滴眼液中抑菌劑等特殊輔料（如羥苯乙酯），連續(xù)進(jìn)樣多針后對(duì)后續(xù)樣品測(cè)定造成干擾。故選擇在條件相對(duì)較優(yōu)的BP2020 基礎(chǔ)上對(duì)色譜柱和洗脫程序等進(jìn)一步優(yōu)化。分別考察以下色譜柱（1）Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（2）J＆K C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（3）Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）。發(fā)現(xiàn)采用色譜柱（1）和（2）時(shí)，利巴韋林由于其極性強(qiáng)，保留時(shí)間較短，與堿破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)A 分離度不能達(dá)到4.0。采用色譜柱（3）時(shí)，利巴韋林峰保留時(shí)間約為9 min，雜質(zhì)A 與主成分峰間分離度約為8.2，各雜質(zhì)間分離度均良好。在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)梯度洗脫程序，由于利巴韋林與滴眼液中特殊輔料如羥苯乙酯極性差異較大，因此本法增加乙腈梯度洗脫的程序。

3.2 不合格樣品原因分析

以擬訂限度判斷，本次抽取的96 批樣品有關(guān)物質(zhì)合格率為81.2%，其中，D 企業(yè)2 批樣品均不合格，均為雜質(zhì)A 超出限度，其檢出量為2.94%～2.98%；F 企業(yè)15 批樣品中14 批不合格，均為雜質(zhì)A 超出限度，其檢出量為0.53%～0.73%；J 企業(yè)14 批樣品中2 批不合格，均為總雜超出限度，其檢出量為1.06%～1.08%。

不合格樣品主要由雜質(zhì)A 含量超出限度（0.5%）導(dǎo)致，通過(guò)強(qiáng)制降解試驗(yàn)及影響因素試驗(yàn)可知，雜質(zhì)A 為利巴韋林的主要降解雜質(zhì)，高溫、氧化、堿性條件均會(huì)導(dǎo)致其大量產(chǎn)生。分析企業(yè)處方和工藝流程，如D 企業(yè)處方中含有氫氧化鈉（約3.75 μg·mL－1），生產(chǎn)工藝中采用沸水溶解原輔料，可能出現(xiàn)高溫條件下局部堿性過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致利巴韋林降解產(chǎn)生雜質(zhì)A。因此，建議企業(yè)在生產(chǎn)工藝過(guò)程中關(guān)注原輔料的溶解溫度，避免用煮沸的方式使其溶解。同時(shí)，在使用氫氧化鈉等堿性pH 調(diào)節(jié)劑時(shí)注意其加入方式，避免局部堿性過(guò)濃造成利巴韋林的降解。

3.3 J 企業(yè)樣品生產(chǎn)時(shí)間與雜質(zhì)量相關(guān)性分析

J 企業(yè)的14 批樣品測(cè)定結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間約為0.62 的雜質(zhì)的檢出量為0.02%～0.34%，查閱其批號(hào)，發(fā)現(xiàn)含量為0.02%的樣品批號(hào)為200301（生產(chǎn)日期為2020年3月），含量為0.34%的樣品批號(hào)為190703（生產(chǎn)日期為2019年7月），同時(shí)期生產(chǎn)的樣品有關(guān)物質(zhì)含量相當(dāng)（見圖6），提示該企業(yè)雜質(zhì)含量隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)增長(zhǎng)趨勢(shì)較為明顯，存在質(zhì)量隱患。

圖6 J 企業(yè)質(zhì)隨批號(hào)變化趨勢(shì)圖Fig 6 Impurity change trend with batch number of J company

3.4 抑菌劑使用合理性分析

采用有關(guān)物質(zhì)檢查方法，K 企業(yè)的17 批樣品中，2-磺基苯甲酸檢出量為利巴韋林標(biāo)示量的0.32%～0.44%。按硫柳汞鈉標(biāo)示量計(jì)算，則約為16%～22%，硫柳汞鈉大量降解，可能樣品中存在一定量的硫柳汞鈉分解產(chǎn)生的氯化乙基汞，氯化乙基汞為劇毒物質(zhì)[11]，其中人經(jīng)口吸收，最小致死劑量為30 mg·kg－1，1 mg·L－1可致人Hela 細(xì)胞突變，同時(shí)還具有一定的生殖毒性。氯化乙基汞可經(jīng)口、呼吸道、皮膚和黏膜吸收，大劑量接觸可造成急性中毒，低劑量長(zhǎng)期接觸可造成慢性中毒[12]，對(duì)人的神經(jīng)、心臟、皮膚等系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，存在較大安全隱患。因此建議硫柳汞鈉從處方中去除，且處方中不應(yīng)與氯化鈉配伍使用。