高效液相色譜法同時測定紅旱蓮中5個黃酮類成分的含量

王慧，辛愛玲，馮璐杰，任小凡，李元偉，董俊青（洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023）

紅旱蓮又名湖南連翹、黃海棠等，為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物黃海棠（Hypericum ascyronL.）的干燥地上部分[1]，具有涼血止血、活血調經、平肝消腫、清熱解毒之功效[2]。在我國分布較廣，除新疆、青海外，我國東北地區及黃河、長江、珠江流域均有分布。民間多用于止痛、抗菌消炎、治療創傷等[3]。據研究報道，紅旱蓮含有豐富的黃酮類生物活性物質，其提取物具有降血脂、抗氧化、抗抑郁、抗病毒、抑制組胺釋放等藥理活性[4-8]。目前文獻中對紅旱蓮總黃酮的研究比較多，但對其各部位黃酮類化合物分布的研究較少，且對于紅旱蓮的采收期、藥用部位等雖有文獻記載，但標準并不統一，如藥用部位有全草入藥和地上部分入藥[8-10]。本研究以蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷5 個黃酮類成分作為指標成分，對不同產地、不同采收期、不同藥用部位的紅旱蓮進行多組分含量分析及比較，為確立紅旱蓮適宜采收期和藥用部位，完善紅旱蓮的質量標準及紅旱蓮資源的合理利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀、Agilent ChemStation 色譜工作站（美國Agilent Technologies 公司）；MSA225S-000-DU 電子天平（德國Sartorius公司）；BSA224S-CW 電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KQ-400DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材

28 批紅旱蓮樣品，經洛陽市食品藥品檢驗所辛愛玲副主任中藥師鑒定均為藤黃科植物黃海棠（Hypericum ascyronL.）的干燥地上部分，具體信息見表1。

表1 樣品來源Tab 1 Source of samples

1.3 試藥

對照品蘆丁（批號：100080-200707，純度：90.5%）、金絲桃苷（批號：111521-201507，純度：94.3%）、槲皮素（批號：100081-201610，純度：99.1%）、異槲皮苷（批號：111809-201804，純度：97.2%）、山柰苷（批號：110861-202013，純度：93.2%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、磷酸為色譜純（DiKMA 公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～25 min，15%B；25～45 min，15%～55%B；45～50 min，55%～15%B）；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為360 nm；柱溫為35℃；進樣量為10 μL。在此條件下，5 個成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數均高于6000，對稱性良好，空白溶劑對測定結果無干擾（見圖1）。

圖1 混合對照品溶液（A）、供試品溶液（B）及空白溶劑（C）HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance（A），sample solution（B）and blank solvent（C）

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷適量，加甲醇超聲溶解并定容，制成每1 mL 分別含蘆丁0.026 90 mg、金絲桃苷0.021 37 mg、槲皮素0.032 72 mg、異槲皮苷0.026 73 mg、山柰苷0.017 70 mg 的混合對照品溶液，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取過2 號篩的紅旱蓮粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液適量，配制系列質量濃度對照品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定。以各成分峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，進行線性回歸，其回歸方程和線性范圍見表2。

表2 各種成分的線性關系Tab 2 Linerity of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精密量取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄色譜圖并計算5 個化學成分峰面積的RSD。結果各組分色譜峰保留時間波動均小于0.2 min，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷峰面積RSD分別為0.72%、0.81%、0.67%、0.23%、0.42%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批供試品（S9）溶液，室溫下放置，分別于0、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，測得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷峰面積RSD分別為0.59%、0.47%、0.81%、0.42%、0.71%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品（S9）約1 g，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算各成分含量及其RSD。結果蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷平均質量濃度分別為0.1562、0.3058、0.3233、0.5951、0.1840 mg·g－1，RSD分別為0.82%、0.96%、0.78%、0.43%、0.61%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 稱取已知含量供試品（S9）9 份，每份約1 g，分成3 組，精密稱定，分別加入含蘆丁0.0629 mg·g－1、金絲桃苷0.1226 mg·g－1、槲皮素0.2381 mg·g－1、異槲皮苷0.1293 mg·g－1、山柰苷0.0741 mg·g－1的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算5 個成分加樣回收率均在98.27%～103.72%，RSD均在0.43%～0.75%。

2.4.6 樣品含量測定 精密稱取16 批不同產地的供試品（地上部分，見表3）、5 批產自或采自河南南陽的供試品（不同部位，見圖2）及河南4 個產地不同采集時間的供試品（地上部分，見圖3），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件下平行進樣2 次，記錄色譜圖，按外標法計算各組分含量。

圖2 紅旱蓮不同部位5 個黃酮類成分總含量分布（mg·g－1）Fig 2 Total content of 5 flavonoids in different parts of Hypericum ascyron L.（mg·g－1）

圖3 紅旱蓮不同采收期5 個黃酮類成分總含量比較（mg·g－1，n ＝16）Fig 3 Total content of 5 flavonoids in different harvest periods of Hypericum ascyron L.（mg·g－1，n ＝16）

表3 樣品含量測定結果(mg·g－1)Tab 3 Content determination (mg·g－1)

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

比較不同品牌色譜柱[COSMOSIL Packed 5 C18-MS-Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agela venusil XBD C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）]對試驗結果的影響，結果各成分色譜峰分離度均達到滿意效果，證明該方法耐用性良好。

3.2 方法學條件的優化與選擇

采用DAD 檢測器在200～400 nm 波長對各考察成分進行光譜掃描，發現各成分均在360 nm波長處有較大吸收；對流動相、柱溫、流速、提取溶劑、提取方式均進行了考察，在保證含量穩定、分離度、信號強度較好的前提下，以提取完全及節約時間成本為尺度綜合考慮，最終確定了本研究所需的色譜條件。

3.3 含量測定結果分析

所有批次的紅旱蓮均檢測出蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷、山柰苷這5 個黃酮類成分。各產地之間5 個黃酮類成分總含量差異較大，其中南陽產的含量偏高；單個成分的含量槲皮素最高，依次是異槲皮苷、金絲桃苷、山柰苷、蘆丁。5 批南陽產紅旱蓮不同部位的5 個黃酮類成分總含量也存在顯著差異，依次為果實＞莖＞地上部分＞花＞葉＞根。這種差異可能與植物自身遺傳因素、植物生長發育進程、所處生長環境有關，也可能與植物器官所承擔的功能有關[11-12]。根據河南不同產地的紅旱蓮連續4 個月的考察結果可知，7～9月份5個黃酮類成分總含量相對較高，8月份達到最高，為紅旱蓮最佳采收時間提供了數據支持。

3.4 小結

本研究建立了高效液相色譜法同時測定紅旱蓮中5 個黃酮類成分含量的方法，并用此方法對紅旱蓮進行多組分、多角度的測定分析，為指導紅旱蓮的最佳采收時間和資源合理利用方面提供了科學依據。