注射用長春西汀中兩種磺酸酯類基因毒性雜質的測定

焦潔，王濤，妙苗（陜西省食品藥品監督檢驗研究院，西安 710065）

注射用長春西汀是由主藥長春西汀和輔料甘露醇、山梨醇等制成的無菌粉針劑，臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動脈硬化癥等誘發的各種癥狀[1]。其主要成分長春西汀是以長春胺為起始原料，經脫水消除反應、水解反應和酯化反應制得。在長春西汀中間體制備過程中使用了對甲苯磺酸作為催化劑，雖然在后續處理過程中進行了充分的洗滌，但仍然可能殘留對甲苯磺酸，在后續的酯化反應中會繼續反應生成對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯。對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯為基因毒性雜質，因此需要在成品質量中嚴格控制其含量。

目前，對甲苯磺酸酯類的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-7]、液質聯用法[8-11]、氣質聯用法[12-13]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高等優點。注射用長春西汀中這兩種基因毒性雜質的測定還未見有報道。本研究建立了 HPLC 法測定注射用長春西汀中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯的含量，為該藥中潛在有害雜質的檢測提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），XPE-105 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

對甲苯磺酸甲酯（批號：F1012054；純度：98.0%）、對甲苯磺酸乙酯（批號：E1012037；純度：98.0%）（對照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；注射用長春西汀（15 個廠家，共計92 批樣品，包括5 mg、10 mg、20 mg、30 mg 4 種規格）；磷酸（西安試劑廠，分析純），乙腈（美國天地公司，色譜純），水為高純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：225 nm；柱溫：35℃，進樣體積：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯各適量，用流動相溶解并稀釋成含對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯各約0.25 μg·mL－1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品1 支，精密加入流動相適量，振搖使溶解并稀釋制成每1 mL含長春西汀約為5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 輔料空白溶液制備 根據各生產企業提供的注射用長春西汀處方，取甘露醇、枸櫞酸、山梨醇、焦亞硫酸鈉、維生素C、酒石酸、活性炭、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉等輔料適量，配制輔料空白，稱取適量，用流動相溶解并過濾，作為注射用長春西汀輔料空白溶液。

2.3 系統適用性和專屬性試驗

取流動相（空白溶液）、對照品溶液、加標供試品溶液（按“2.5”項下方法配制）和輔料空白溶液，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結果顯示，對照品溶液出峰順序依次為對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯，分離度為9.2，理論塔板數分別為13 359 和13 880，空白溶液和輔料對測定無干擾。

圖1 專屬性色譜圖Fig 1 Specific chromatogram

2.4 線性關系考察

精密稱取對甲苯磺酸甲酯12.24 mg 和對甲苯磺酸乙酯9.27 mg 同置100 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻。精密量取2.5 mL，置100 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1、1.5、2、3 和4 mL，分別置20 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋到刻度，搖勻即得線性對照品溶液。

精密量取線性對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測試，分別獲得相應線性方程。對甲苯磺酸甲酯：Y＝6.36×104X－3.09×102，r＝1.000；對甲苯磺酸乙酯：Y＝6.12×104X－3.17×102，r＝1.000；對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯分別在0.15～0.60 μg·mL－1，0.11～0.45 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 回收試驗

考慮到各企業之間工藝和處方的差別，選擇注射用長春西汀使用輔料最多的A 公司樣品進行加樣回收試驗。取A 公司生產的批號為DB190101 的樣品6 支（規格10 mg，對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯均未檢出），精密加入線性對照品溶液適量，搖勻。

精密量取對照品溶液和上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣，按外標法計算回收率。對甲苯磺酸甲酯平均加樣回收率為98.9%，RSD＝1.2%；對甲苯磺酸乙酯平均加樣回收率為99.5%，RSD＝1.6%。結果表明方法準確度符合要求。

2.6 重復性試驗

回收率試驗6 份加標樣品中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯含量均值分別為0.0059%、0.0045%，RSD均小于1.6%，表明方法的重復性符合要求。

2.7 定量限和檢測限

取線性對照品溶液逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的定量限（S/N≈10）分別為0.037 μg·mL－1和0.045 μg·mL－1，檢測限（S/N≈3） 分別為0.015 μg·mL－1和0.023 μg·mL－1。

2.8 精密度試驗

精密量取甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯對照品溶液20 μL（質量濃度分別為0.3、0.23 μg·mL－1，如前配制）連續進樣6 次，測得兩者峰面積的RSD分別為0.91%和2.0%。表明儀器的精密度良好。

2.9 穩定性試驗

取對照品溶液于室溫放置 0、1、2、3、4、5、6 h，分別進樣分析，記錄色譜圖，結果發現對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積有變小的趨勢，但在6 h 內峰面積變化RSD＜2.0%，建議供試品溶液在配制后6 h 內測定。

2.10 樣品含量測定

取92 批注射用長春西汀樣品，分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。按外標法計算，結果均未檢出甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯。

3 討論

3.1 流動相的優化

試驗中先后考察了① 乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61），檢測波長為225 nm；② 乙腈-水（40∶60），檢測波長為220 nm；③ 乙腈-0.2 mol·L－1醋酸銨溶液（50∶50），檢測波長為260 nm 3 種體系。結果發現，3 種流動相均可滿足系統適應性要求，但③的檢出限是①和②的10倍，且②的系統耐用性較差，故采用流動相①。

3.2 色譜柱的選擇

試驗中先后考查了①Waters ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、②Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、③ACE Excel C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱。結果發現，在采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相條件下，3 種色譜柱均可滿足系統適應性要求，但在使用②和③色譜柱時2 種待測物均在長春西汀主成分之后出峰，由于供試品溶液濃度較大，有一定程度的拖尾，導致2 種待測物的靈敏度低，達不到限度要求。采用色譜柱①，待測物在長春西汀主峰前流出，可以杜絕高濃度樣品拖尾對待測組分的干擾，降低基線噪音，提高檢測的靈敏度。

3.3 待測物的確認

試驗過程中發現，部分廠家供試品溶液色譜圖中，在待測物甲苯磺酸甲酯保留時間附近還有其他色譜峰，為排除因保留時間漂移引起的漏檢，對上述樣品均進行加標回收驗證，結果表明，該色譜峰不是待測物，為長春西汀原料引入的雜質。

3.4 限度的確定

根據ICH 規定，基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 μg·d－1，長春西汀每日最大用量為30 mg，按此計算，確定本品中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的限度為50 ppm，即不得過0.005%。