肉蓯蓉復方顆粒對大鼠骨質疏松癥的治療作用

徐雙華，吳清（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.北京中京豐創科技有限公司，北京 100070）

骨質疏松癥是一種內分泌、營養、免疫、遺傳多種復合因素引起的代謝性疾病，大部分患者屬于原發性骨質疏松，主要是因年齡增加所致，在老年人、絕經后婦女和惡性腫瘤患者中發生率較高。因此，研究防治骨質疏松的藥物極為重要。

研究表明，肉蓯蓉能提高性激素水平[1-2]、促進骨形成[3-5]、抑制骨吸收[6]；菊粉可以增加鈣結合蛋白的表達與磷的生物利用度、提高鈣吸收與全身骨骼礦物質參數[7-8]；硫酸軟骨素能促進成骨細胞增生和新骨形成[9]。本研究將肉蓯蓉、菊粉與硫酸軟骨素組成復方制劑，研究以去卵巢所致骨質疏松大鼠為對象，觀察由上述復方制劑增加動物骨密度及相關蛋白表達的效果，為治療和預防骨質疏松的作用提供依據。

1 材料

肉蓯蓉（經北京中醫藥大學鑒定為肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma），菊粉（比利時BENEO ORAFTI），硫酸軟骨素鈉片（四川省尚善堂制藥有限公司），注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司），戊酸雌二醇（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司），骨鈣素（BGP）試劑盒（上海聯碩生物科技有限公司），堿性磷酸酶（ALP）ELISA 試劑盒（上海聯碩生物科技有限公司），BMP-2 抗體（北京四正柏生物科技有限公司，4AK201716F），組織蛋白酶K（CK）試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司），脫氧吡啶啉（DPD）ELISA 檢測試劑盒（上海研域儀器設備有限公司），白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），戊巴比妥鈉（德國默克公司，批號：20160411），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（上海穎心實驗室，批號：TX20149）。NORLAND-Stratec 周圍型雙能X 線骨密度儀（北京邁爾思瀛海威醫療技術有限公司）；離心機（北京京立離心機有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

Wistar 大鼠[北京維通利華動物技術有限公司提供，SPF 級健康雌性大鼠，實驗單位使用許可證號：SYXK（京）2010-0025]，體質量（300±20）g。所有動物均放置于恒溫、清潔的環境中。溫度（22±2）℃，相對濕度（65±5）℃，光照12 h，黑暗12 h，動物自由攝食、攝水。

2 方法

2.1 肉蓯蓉復方顆粒的制備

肉蓯蓉200 g，粉碎，按照料液比1 ∶20 加入提取液（70%乙醇），在50℃條件下，提取時間為50 min，重復提取兩次，提取液回收溶劑并濃縮，烘干得到肉蓯蓉浸膏，與300 g 菊粉、硫酸軟骨素25 g 混合均勻后，通過傳統的濕法制粒制成顆粒。

2.1 大鼠骨質疏松模型的建立

將大鼠按體質量隨機分為6個組，每組10只，分別為假手術組（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），去卵巢模型組（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），戊酸雌二醇陽性對照組（1 mg·kg－1），肉蓯蓉復方顆粒高、中、低劑量組1100、550、275 mg·kg－1（給藥劑量分別為處方劑量的2 倍、1 倍、0.5 倍）。

手術前稱重，按照30 mg·kg－1劑量，經腹腔注射戊巴比妥鈉溶液實施麻醉，待大鼠麻醉起效后，腹位固定后于腹中線距陰道口3～4 cm 除去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2～3 cm，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮后，輕輕將一側子宮角拉出，在其末端可見被脂肪團包裹的卵巢，然后將卵巢下端輸卵管用絲線結扎，切除雙側卵巢，順勢將子宮角送回腹腔中，同法剪除另側卵巢。其中假手術組僅僅切除卵巢附近的部分脂肪組織，不結扎輸卵管、不切除卵巢，縫合切口，再次消毒，術后腹腔注射青霉素鈉，1 次·d－1，連續3 d，防止術后感染。術后大鼠的活動正常。術后觀察7 d，然后開始每日下午灌胃給予對應藥物，每周稱重一次，12 周后大鼠灌胃結束。

2.2 檢測指標

2.2.1 體質量 每周測定大鼠體質量一次，據此調整灌胃量。

2.2.2 股骨干質量測定 大鼠喂養12 周后處死，剝離出左、右股骨。取左側股骨于105 ℃烤箱中烤至恒重，稱定股骨干質量。

2.2.3 骨密度測定 用美國NORLAND-Stratec周圍型雙能X 線骨密度儀（PDEXA）測定右側股骨重點及股骨遠心端的BMD 值（g·cm－2）。

2.2.4 大鼠血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α的測定 給藥12 周后，麻醉大鼠，腹部下部開口，暴露腹主動脈，使用一次性采血針與配套的采血管，與腹主動脈下部Y 字岔口處進針取血，每只大鼠約取5 mL 全血。室溫靜置4 h，使血液完全凝固，3500 r·min－1離心10 min，取血清。按照試劑盒說明，測定血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6 和TNF-α水平。

2.2.5 BMP-2 表達的測定 留取完整的右股骨段，并迅速投入液氮中，后轉移至－80℃保存，用于提取蛋白；用裂解液超聲提取總蛋白后，Western blot 法測定BMP-2 表達。

2.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計量資料采用方差分析方法，均以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠體質量及骨參數變化

如表1所示，相比較于模型組，肉蓯蓉復方顆粒高劑量組、中劑量組（P＜0.01，P＜0.05）大鼠體質量增加量顯著降低，表明肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組對雌激素缺失導致骨髓間質細胞轉化為脂肪細胞，具有良好的抑制作用，其中肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組股骨干質量、BMD顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），表明肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組具有提高大鼠BMD及股骨干質量的作用。

表1 肉蓯蓉復方顆粒對骨參數的影響Tab 1 Effect of cistanche compound granules on the bone parameters

3.2 大鼠血清指標變化

3.2.1 血清中ALP、BGP 水平 如表2所示，與假手術組比較，模型組大鼠由于雌激素的缺失會代償性增加ALP 和BGP 的分泌，其在血清中含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組大鼠血清ALP 和BGP 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明高、中劑量肉蓯蓉給藥組能夠有效地逆轉ALP 和BGP升高的趨勢，起到治療骨質疏松的作用。陽性對照組大鼠的ALP（P＜0.05）和BGP 顯著降低（P＜0.01）。

表2 肉蓯蓉復方顆粒對血清ALP、BGP 的影響Tab 2 Effect of cistanche compound granules on serum ALP and BGP

3.2.2 血清中CK 和DPD 含量變化 如圖1所示，與模型組比較，陽性對照組、肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組的CK 和DPD 酶活力水平顯著性降低（P＜0.05，P＜0.01），肉蓯蓉復方顆粒通過抑制CK 和DPD 酶的活力，從而抑制骨吸收。

圖1 肉蓯蓉復方顆粒對組織蛋白酶（A）和DPD（B）的影響Fig 1 Effect of cistanche compound granules on serum CK（A）and DPD（B）

3.2.3 血清中IL-6 和TNF-α含量變化 如圖2所示，與模型組比較，肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組的IL-6、TNF-α水平減少（P＜0.01），抑制水平接近陽性對照組，表明肉蓯蓉復方顆粒通過調節IL-6、TNF-α的表達，降低破骨細胞增殖，抑制骨吸收。

圖2 肉蓯蓉復方顆粒對IL-6（A）及TNF-α（B）的影響Fig 2 Effect of cistanche compound granules on serum IL-6（A）and TNF-α（B）

3.3 大鼠BMP-2 蛋白表達

如圖3所示，骨組織中可檢測到BMP-2 蛋白表達，模型組的蛋白條明顯低于假手術組，說明去勢大鼠的BMP-2 表達減少，肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組BMP-2 蛋白表達高于模型組，接近陽性對照組，說明肉蓯蓉復方顆粒可增強BMP-2蛋白表達，其中中劑量組的效果最好。

圖3 各組大鼠骨組織中BMP-2 蛋白表達圖Fig 3 Expression of BMP-2 protein in the bone tissues of rats in different groups

4 討論

去勢大鼠骨質疏松模型是研究動物骨質疏松采用的一種模型，去卵巢大鼠是研究絕經后婦女骨質疏松的一個常用動物模型，具有手術簡單，重復性、穩定性好等優點[10]。因此，采用此模型能比較客觀地評價肉蓯蓉復方顆粒對骨質疏松癥的治療作用。

在肉蓯蓉復方顆粒對骨參數的影響實驗中，模型組大鼠骨密度明顯下降，破骨細胞和成骨細胞無法保持平衡，骨量快速丟失。通過肉蓯蓉復方顆粒進行治療后，可顯著提高骨密度、股骨干質量，改善去卵巢大鼠骨質疏松的狀態，抑制骨量的繼續丟失。

ALP 作為成骨細胞分泌物，其與血液中的鈣離子相互作用，促進骨質的合成，可反映成骨細胞的活性[1，11]，ALP 促進有機磷酸化合物分解為無機磷酸離子，使磷酸離子與鈣離子結合沉淀于骨內，BGP 也是由成骨細胞分泌，是骨形成和骨重建的反映指標之一[12-13]，兩者均可反映成骨細胞的活性[14-15]，ALP 和BGP 水平越高，說明體內越缺鈣[16]。本研究中，通過手術去卵巢處理，構建骨質疏松大鼠模型，發現模型組大鼠ALP 和BGP 含量升高，而肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組可顯著降低其含量，說明肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量可以有效調節骨代謝平衡，抑制骨吸收，治療骨質疏松。

BMP2/Smad 信號通路可以調控成骨細胞的全部過程，其功能障礙會引起骨量降低和骨形成減少，導致骨質疏松癥發生[17]。BMP2 是經典BMPs/Smad 通路的重要配體[18-20]，BMP2 是BMPs 家族中非常重要的一個亞型，其可以刺激間充質干細胞分化為成骨細胞，促進成骨細胞轉化為骨細胞，是促進骨形成和誘導成骨細胞分化的重要的信號分子之一[21-23]。本研究中，發現模型組大鼠的BMP-2 蛋白表達明顯降低，說明BMP2/Smad 通路的信號傳遞減弱，影響成骨細胞分化，進而影響骨密度水平，肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組可以上調BMP-2 蛋白水平，蛋白表達水平接近陽性對照組，進而調節BMP2/Smad通路的信號傳遞，促進成骨細胞分化，起到治療骨質疏松的作用。

CK 是組織蛋白酶溶酶體蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶成員。它被認為可降解骨基質蛋白，骨橋蛋白和骨粘連蛋白[24]，血清中的CK 是骨吸收的典型標志物[25]，其過度表達會增加松質骨轉換，阻止CK 表達可抑制骨吸收，有利于骨基質的穩定性[26]。DPD 也是典型的骨吸收標志物[27-28]，當骨吸收作用增強，成熟的Ⅰ型骨膠原分解，DPD 作為降解產物被釋放到血液中，DPD具有組織特異性，不受飲食影響，其只在骨吸收及骨溶解時才被釋放入血。因此，血清DPD 水平升高，說明骨吸收增強[29]，本研究發現，發現模型組大鼠的CK 和DPD 含量升高，說明骨吸收增強，肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組可以顯著性降低CK 和DPD 含量，接近陽性對照組，抑制骨吸收，從而有效對抗骨質疏松的發生。

細胞因子IL-6、TNF-α是調節骨吸收的關鍵因素[30]，IL-6 作為一種生物活性因子，可通過多種方式參與到成骨細胞和破骨細胞的功能調控，是促進破骨細胞增殖分化的重要因子[31]，IL-6 可以通過SHP2/P13K/Akt2 和SHP2/MEK/ERK 通路抑制成骨細胞分化，TNF-α是促進骨吸收的細胞因子[32]，可作用于前體破骨細胞，使其分化為破骨細胞，促進破骨細胞生成，增強骨吸收。TNF-α還可通過影響OPG/RANKL/RANK 信號系統，以旁分泌的方式調節破骨細胞活化，刺激骨吸收[16]。本研究發現，模型組大鼠的IL-6、TNF-α水平顯著升高，說明模型組大鼠骨吸收增強，骨質遭到破壞，而肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量組可顯著降低的IL-6、TNF-α水平，接近陽性對照組水平，說明肉蓯蓉復方顆粒高、中劑量可以抑制大鼠體內IL-6、TNF-α的表達，通過影響SHP2/MEK/ERK、SHP2/P13K/Akt2 和OPG/RANKL/RANK 通路，降低破骨細胞增殖，抑制骨吸收，有效治療骨質疏松。

近年來，許多研究證明補腎類中藥在治療老年性骨質疏松癥的研究中取得了較滿意的結果，本方針對中老年人全身性骨量減少，骨密度損失及骨組織的微觀結構退化所致的骨脆性增加、骨密度降低、骨折危險性增加的特點，選用具有補腎壯陽、補精益髓功效的肉蓯蓉，輔以具有促進鈣和礦質吸收，降低骨代謝過程作用的菊粉及促進成骨細胞增生和新骨形成的硫酸軟骨素，有效改善了去卵巢大鼠骨質疏松的狀態，為治療和預防骨質疏松的作用提供依據。