外泌體miR-155通過調節SOCS1影響重癥急性胰腺炎肺損傷

繆寶洲，汪敬恒，鐘俊峰，潘恩，林秀麗

福建中醫藥大學附屬福鼎市醫院重癥醫學科，福建福鼎355200

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是ICU常見疾病，隨著生活方式的改變，發病日趨年輕化[1-2]。重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）患者伴有或者不伴有多臟器功能衰竭（mutiple organ failure,MOF），決定了其嚴重程度，尤其是急性肺損傷（acute lung injure,ALI）[3]和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）[4]。外泌體排出細胞外并攜帶核酸傳遞信息，可穿透血管壁，同時可穿透細胞外基質[5]，其中MicroRNA即為外面運輸核酸之一，從而影響下游基因表達[6-7]。SAP-ALI的內皮細胞通透性發生改變，可能導致外泌體的分泌增多，攜帶MicroRNA增多[8]。

AP發生發展過程中，胰液的釋放會導致胰腺自我消化[9]，從而產生IL-17的CD4+T輔助細胞（Th17）的積聚[10]。文獻中已經證實SOCS1調節STAT5，STAT5是Treg細胞的統計調節器[11]。Wang等[12]人研究發現，miR-155可以抑制SOCS1，從而影響AP的發生發展過程。設想miR-155通過外泌體包裹轉運可以通過SOCS1影響SAP-ALI的過程。因此該文方便選取福建中醫藥大學附屬福鼎醫院重癥醫學科（ICU）2019年1—12月收治入院的128例急性胰腺炎患者血漿進行了相關研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

方便選取福建中醫藥大學附屬福鼎醫院重癥醫學科（ICU）收治入院的128例急性胰腺炎患者血漿，其中急性胰腺炎伴肺損傷（AP with ALI,AWA）35例，急性胰腺炎不伴肺損傷（AP without ALI,AOA）93例，采集8名非患者志愿者血漿，年齡39~53歲。根據伴有或者不伴有ALI將患者分成兩組，AWA組35例，男女比例為17例∶18例，平均年齡為（48.6±16.1）歲；AOA組93例，男女比例為44例∶49例，平均年齡（45.6±16.5）歲。采集8名非患者志愿者血漿，平均年齡（46.3±4.17）歲。簽署知情同意書后，經過福建中醫藥大學附屬福鼎醫院倫理委員會論證通過，倫理委員會批準文號：鼎醫綜〔2020〕124號。外泌體大體試劑盒：德國QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集因胰腺炎急診入院的患者外周血3~5 mL，抗凝，至實驗室離心，低速1 000 g，10 min。取上層血漿至1.5 m LEP管，分裝做好標記，-80℃保存備用。

1.2.2 提取外泌體將標本從儲存管中取出，用200 mL XBP緩沖液與血漿等體積混合，收集混合液體，注入exoEasy濾柱中離心。使用PexoEasy濾柱加入緩沖液后離心。在濾網膜上，室溫孵育1 min。離心，5 000 g，5 min，備用。

1.2.3 提取RNA加入400 μl酸化酚氯仿，通過震蕩方式進行混勻，時間30~60 s。混勻后加入20 μl外部參照cel-miR-39(5 pmol/L)。純乙醇萃取離心結束。洗滌，離心條件為室溫9 500 g，空轉1 min后棄去收集管，用新的收集管將洗脫液預熱至95℃。預熱好洗脫液后加入濾膜中，根據上述條件再離心30 s，回收收集管內濾液。檢測收集到的溶液。

1.2.4 進行miR-155的熒光定量檢測 以U6為內參基因，U6及miR-155特 異 引 序 列 為，miR-155:Forward primer:5'-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3'，Reverse primer:5'-CATCACAGACCTGTTATTGC-3'；內 參U6:Forward primer:5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3'，Reverse primer:5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3'。

1.3 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據，PCR以celmiR-39作為外源性參照，miR-155相對表達量計算公式45-Ct=45-（CtmiR-155-CtmiR-39）。miR-155結果中，每個樣本設置3個重復，取算術平均值。計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體鑒定

Western blot結果提示，β-actin未在外泌體檢測出，外泌體未被污染；外泌體組，TSG101和CD81特異性標志物表達升高，外泌體分離成功，見圖1A。用細胞攝取動態光散射分析，發現外泌體平均直徑為（80.69±18.11）nm，同時證實外泌體具有膜結構呈囊泡狀，見圖1B。

圖1 外泌體鑒定：A.western blot結果顯示TSG101和CD81表達；B.外泌體的形態

2.2 3組血漿外泌體miR-155水平比較

AWA患者血漿外泌體miR-155的相對表達量為（15.11±2.18），AOA患者血漿外泌體miR-155的相對表達量為（10.64±1.65），非患者志愿者（NC）血漿外泌體miR-155的相對表達量為（5.19±0.44）。AOA組血漿外泌體miR-155水平顯著高于健康志愿者（P＜0.01）；AWA組血漿外泌體miR-155水平顯著高于AOA組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 外泌體miR-155在AWA患者血漿中的表達情況

2.3 miR-155直接靶點SOCS1的確定

為了研究miR-155的潛在靶基因，利用targetscan軟件進行了生物信息學分析。使用這種方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中預測miR-155結合位點，見圖3A。為了檢測miR-155對SOCS1的調節作用，對CD4+T細胞進行了雙熒光素酶報告試驗。細胞共轉染了野生型（WT）或突變型（MUT）SOCS13’-UTR質粒和miR-155或對照miR轉染。MiR-155顯著抑制WT的熒光素酶報告活性，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），但不抑制MUT-SOCS13’-UTR，表明SOCS1是MiR-155的直接靶點（圖3B）。RT-PCR分析miR-155轉染細胞中的SOCS1，證實miRNA下調了CD4+T細胞中SOCS1的表達，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3，用miR-155抑制劑處理細胞可逆轉這種作用，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3C。

圖3 miR-155直接靶點SOCS1的確定。A.miR-155和SOCS1 mRNA的序列匹配；B.WT或MUT SOCS1 3’-UTR與miR-155或對照miR共轉染的熒光素酶檢測報告；C.轉染后3天CD4+T細胞SOCS1的Rt-PCR分析

2.4 3組血漿CD4+T細胞中SOCS1表達情況比較

為探討miR-155對AP和ALI的作用機制，進一步研究了不同分組中CD4+T細胞的SOCS1的表達情況。研究結果發現，AWA組較AOA組，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。AOA組較正常組，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 western blot實驗和實時定量PCR實驗

3 討論

目前AP的診斷包括兩個方面，臨床表現和實驗室檢查，但尚無準確預測AP嚴重程度的標志物，此標志物需要時間準確性，即必須在早期發現并準確預測。miR-155參與了多種疾病的發生發展[13]，在某些胰腺疾病中，如星狀細胞通過相關機制轉化時，miR-155表達下調[14]。該課題依據以上調查基礎，采集AP患者血漿并分離純化鑒定血漿外泌體，研究發現外泌體miR-155在AWA患者血漿中顯著高表達，AWA患者相對表達量為（15.11±2.18），AOA患者相對表達量為（10.64±1.65），NC組相對表達量為（5.19±0.44）。AWA組血漿外泌體miR-155水平是AOA組的1.5倍，是NC組的3倍，這從側面提示miR-155可能以外泌體形式存在于血漿中，并與AP的病情發展有一定的關系。Jiménez等[15]人發現，AP能夠產生2個不同的外泌體群，它們在細胞分布、蛋白質和miRNA含量上存在相應的差異，并且可以產生不同的生理效應。其中一個即miR-155明顯升高為特點，且miR-21和miR-122降低，其中AP組外泌體miR-155是對照組的4倍，而該文結果中AWA是NC組的3倍，結果相近，與該研究結果相符。說明外泌體miRNA的異常表達，會對疾病產生較大影響，結果顯示，miR-155在AWA患者血漿外泌體中高表達。

那么外泌體miR-155通過什么途徑對AP的嚴重程度發揮作用？有研究顯示，miR-155可通過靶向結合SOCS1發揮抗腫瘤作用，Zhang等[16]發現，miR-155通過直接靶向SOCS1促進間變性甲狀腺癌的進展，其研究結果表明，熒光素酶實驗驗證了miR-155和SOCS1的靶向結合作用，同時能夠抑制甲狀腺癌細胞中SOCS1的表達，降低其表達后從而造成腫瘤進展。該研究進一步研究了miR-155與SOCS1的關系，利用targetscan軟件進行了生物信息學分析。使用這種方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中預測miR-155結合位點（圖3A）。為了檢測miR-155對SOCS1的調節作用，對CD4+T細胞進行了雙熒光素酶報告試驗，結果發現miR-155通過抑制性結合SOCS1 mRNA達到抑制其表達（圖3C），對照組明顯高于miR-155組，約為3倍，得到了與Zhang等人的研究類似的結果。同時進行不同分組之間SOCS1的表達情況分析，結果發現，AWA組較AOA組，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明顯降低（P＜0.05），如圖4所示。AOA組較NC組，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明顯降低（P＜0.05），與外泌體miR-155的表達呈負相關。通過以上結果，推論可以發現，SOCS1參與了AP的發生發展過程，外泌體miR-155通過抑制性結合SOCS1的3’TUR來抑制其表達，影響AP的病程進展。在Wang等[12]的研究中，在胰腺炎中已經證實miR-155可以靶向結合SOCS1并通過這一調節軸對Th17/Treg比率進行調節，SOCS1的表達情況與胰腺炎的嚴重程度相關，與該研究結果一致。綜上所述，外泌體miR-155可以作為預測AP病程進展的標志物，值得進一步深入研究。

外泌體miRNA在近些年研究中呈現明顯的應用優勢，尤其在重癥疾病中，包括胰腺炎、腫瘤、腎纖維化等方面。該研究確定了SOCS1是miR-155的直接靶向結合目標，外泌體源性miR-155在AWA患者血漿中高表達，其可通過調節SOCS1的表達影響重癥急性胰腺炎肺損傷，為外泌體在重癥胰腺炎方面的研究打下基礎。但對其機制仍所知甚少，如外泌體源性miR-155如何發生上調，如何發生下調，是否可以確定界定值范圍，來判斷疾病進展情況，需要繼續深入研究。

綜上所述，外泌體源性miR-155的表達水平與重癥胰腺炎患者的發病情況息息相關，使得它對于疾病的預后判斷十分重要，有望成為診斷和提示預后的生物標志物。因此可進一步對miR-200c的發展潛力進行挖掘，從而更好的為臨床服務。