蒸制工藝對酒女貞子外觀性狀和主要成分的影響△

徐文娟，董海鵬，韓婷，屈文佳，李春帥，魏鋒，李向日*，林瑞超

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥炮制研究中心/北京市中藥品質(zhì)評價重點實驗室，北京 102488；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局 專利局復(fù)審和無效審理部，北京 100088；3.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之效[1-2]。女貞子經(jīng)酒蒸或酒燉為酒女貞子后，其“形如女貞子，表面黑褐色或灰黑色，常附有白色粉霜，微有酒香氣”[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為[3]，女貞子生品性涼，可清肝明目、滋陰潤燥，用于治療肝熱目眩、陰虛腸燥便秘等癥，如菊女飲（《辨證錄》）、女貞湯（《醫(yī)醇剩義》）等。酒制后，補肝腎作用增強且其寒涼之性得以緩解，多用于腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥，如二至丸（《醫(yī)方集解》）、繆仲淳烏發(fā)明目丸（《續(xù)名醫(yī)類案》）等。酒女貞子在現(xiàn)代臨床應(yīng)用廣泛，可用于治療慢性肝炎、高脂血癥、更年期綜合征、老年性便秘、不孕、心悸等，亦可作為放化療輔助藥物。

女貞子主要活性成分為萜類、苯乙醇苷類和黃酮類化合物，具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、調(diào)血脂、抗炎、抗菌、抗衰老等作用[4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酒制對脂溶性萜類齊墩果酸、熊果酸含量無明顯影響[5]，但對環(huán)烯醚萜類與苯乙醇類等化合物含量影響顯著。酒制的24 h 內(nèi)，環(huán)烯醚萜類化合物除女貞酸含量逐漸升高后趨于穩(wěn)定外，特女貞苷、女貞苷、橄欖苦苷等含量均有降低的趨勢[6-7]；除松果菊苷、毛蕊花糖苷等含量下降外，多數(shù)苯乙醇類化合物含量呈現(xiàn)上升或先升后降的趨勢[5,7-8]。女貞子酒制后，其藥理作用也發(fā)生了明顯的變化，抗骨質(zhì)疏松、抗炎抑菌、升白、調(diào)節(jié)免疫等作用增強，并減緩了腸道的蠕動，可緩解生品所致滑腸瀉下的不良反應(yīng)[9-10]?？梢姡懽优c酒女貞子在化學(xué)成分和藥理作用上存在明顯差異。然而，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版中女貞子、酒女貞子均以特女貞苷作為含量測定的指標(biāo)成分，且含量限度一致，均為“含特女貞苷（C31H42O17）不得少于0.70%”，難以體現(xiàn)女貞子酒制的炮制原理，亦難以全面評價酒女貞子的質(zhì)量，無法保證臨床有效用藥。

評價中藥質(zhì)量的方法主要包括傳統(tǒng)鑒別法和有效成分含量評價法，兩者各有利弊。前者主觀性強，難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，后者因忽略性狀，常被指責(zé)為“唯成分論”，結(jié)合兩者優(yōu)勢，才能更加全面客觀評價中藥質(zhì)量。課題組前期對女貞子藥材的性狀與化學(xué)成分之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)女貞子成分與其顏色、百粒質(zhì)量等存在一定關(guān)系[11-12]。本研究基于前期研究，進(jìn)一步探究酒女貞子在蒸制過程中，其外觀性狀（顏色、白霜）及特女貞苷、紅景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蘆丁6 個成分含量的變化規(guī)律（圖1），并對《中國藥典》2015 年版酒女貞子含量測定的方法提出建議。

圖1 女貞子中6個成分結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 儀器

Waters 2489 型高效液相色譜儀；Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；FW-100型高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG 型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；PANTONE 色卡C 版（深圳千通彩色彩管理有限公司）。

1.2 試藥

對照品特女貞苷（批號：111926-201404，純度：97.3%）、紅景天苷（批號：110818-201708，純度：98.8%）、蘆?。ㄅ枺?000-200702，純度：90.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品松果菊苷（批號：16102103，純度≥98.0%）、毛蕊花糖苷（批號：16102103，純度≥98.0%）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；對照品酪醇（批號：J0621RA13，純度≥98.0%）購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

女貞子藥材（產(chǎn)地：河南，批號：022170501）由河北橘井藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實。

2 方法

2.1 不同蒸制時間酒女貞子樣品的制備

參照《中國藥典》2015 年版及《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版中的炮制方法對女貞子藥材進(jìn)行炮制，分別蒸制2、6、12、16、20、24 h，干燥，得不同蒸制時間的酒女貞子樣品。

2.2 蒸制時間對酒女貞子外觀性狀的影響

觀察酒女貞子顏色及白霜隨蒸制時間的變化，并結(jié)合PANTONE色卡對其顏色進(jìn)行評價。

2.3 蒸制時間對酒女貞子中主要成分的影響

按照課題組前期研究建立的方法，對酒女貞子中特女貞苷、紅景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蘆丁的含量進(jìn)行測定[11]。

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）為流動相，梯度洗脫（0～15 min，4%A；15～35 min，4%～6%A；35～60 min，6%～15%A；60～100 min，15%～20%A；100～130 min，20%～40%A）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長分別為230、350 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別取對照品特女貞苷、紅景天苷、酪醇適量，精密稱定，加入甲醇稀釋至特女貞苷、紅景天苷、酪醇分別為0.33、0.31、0.36 mg·mL-1的混合對照品溶液（a）；分別取對照品松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷適量，精密稱定，加入甲醇稀釋至松果菊苷、蘆丁、毛蕊花糖苷分別為0.31、0.30、0.31 mg·mL-1的混合對照品溶液（b）。

2.3.3 供試品溶液的制備 取女貞子樣品中粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min。再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 樣品含量測定 自制酒女貞子樣品中粉按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件測定，計算樣品含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒸制時間對酒女貞子外觀性狀的影響

不同蒸制時間的酒女貞子樣品見圖2，性狀結(jié)果見表1。由圖2及表1可知，在蒸制過程中，隨著蒸制時間的延長，女貞子的顏色逐漸加深，酒蒸0～6 h，其顏色由棕褐色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚橛猩倭堪姿痪普?～12 h，顏色變?yōu)榛液谏?，白霜明顯可見；酒蒸12～24 h，酒女貞子性狀無明顯變化；自制酒女貞子均微有酒香氣。有研究表明，白霜為齊墩果酸，酒制可使女貞子質(zhì)地酥脆，促進(jìn)齊墩果酸的溶出，從而增強療效[13]。女貞子酒蒸過程中顏色加深可能與其發(fā)生美拉德反應(yīng)有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，女貞子在酒燉24 h內(nèi)，其多糖及多數(shù)環(huán)烯醚萜類化合物含量呈下降趨勢[5-7]，水溶性低分子糖含量在酒燉0～24 h內(nèi)呈升高趨勢而后顯著下降[5]，5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量逐漸升高且在酒燉20 h后含量升高最為明顯[5]，表明女貞子酒制過程中多糖及環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產(chǎn)生的低分子糖可能參與美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致飲片顏色加深。另外，環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產(chǎn)生的苷元可進(jìn)一步發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)，亦有可能導(dǎo)致女貞子酒制過程中顏色發(fā)生變化[14]。綜上，女貞子酒蒸過程中顏色變化可能與其多糖及環(huán)烯醚萜類成分存在一定關(guān)系，后續(xù)可量化顏色指標(biāo)，對此進(jìn)一步研究[15-16]。女貞子酒蒸6～24 h 后，其外觀性狀符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標(biāo)準(zhǔn)，表明酒女貞子的蒸制時間應(yīng)不少于6 h。

表1 不同蒸制時間酒女貞子性狀

圖2 不同蒸制時間的酒女貞子樣品

3.2 蒸制時間對酒女貞子中主要成分的影響

女貞子及不同蒸制時間的酒女貞子樣品6 個成分含量測定結(jié)果見表2 及圖3。由表2 及圖3 可知，隨著蒸制時間的延長，裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分特女貞苷含量顯著下降，苯乙醇類成分紅景天苷、酪醇含量隨之升高，與文獻(xiàn)[5-7]報道結(jié)果一致，這與特女貞苷水解生成紅景天苷，紅景天苷進(jìn)一步水解轉(zhuǎn)化為酪醇有關(guān)[6]，其轉(zhuǎn)化規(guī)律見圖4。亦有研究表明，紅景天苷、酪醇含量的升高與女貞苷G13、女貞苷、女貞次苷、oleopolynuzhenide A、oleonuezhenide 等環(huán)烯醚萜類化合物的水解有關(guān)；另外，隨著時間的延長，苯乙醇類成分松果菊苷、毛蕊花糖苷含量也呈現(xiàn)下降的趨勢；黃酮類成分蘆丁含量較少且略有下降[17]。

圖3 酒女貞子蒸制過程中6個成分的含量變化

圖4 特女貞苷的水解

表2 不同蒸制時間酒女貞子的含量測定結(jié)果（n=2） %

目前，已明確酒女貞子蒸制過程中特女貞苷、紅景天苷、酪醇三者間的轉(zhuǎn)化關(guān)系；結(jié)構(gòu)上，松果菊苷僅比毛蕊花糖苷多1 分子葡萄糖，表明松果菊苷在女貞子蒸制過程中可能發(fā)生水解生成毛蕊花糖苷；松果菊苷、毛蕊花糖苷受熱水解可生成羥基酪醇、咖啡酸等化合物，蘆丁受熱水解可生成槲皮素。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件對酒女貞子蒸制過程中6 個成分含量的變化趨勢進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。從表3 中可以發(fā)現(xiàn)，6 個成分含量變化呈強相關(guān)，表明6 個成分間在含量變化趨勢上存在相關(guān)性。目前未見女貞子產(chǎn)生不良反應(yīng)的相關(guān)報道，其經(jīng)酒制后療效增強與有效成分含量升高關(guān)系密切。由于紅景天苷、酪醇含量變化趨勢成極顯著正相關(guān)（Y=0.1X+0.05，r=0.849）且酪醇含量較低，而紅景天苷含量較高、活性強，具有保肝、保腎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管、抗衰老[18]等作用，與酒女貞子的功效一致，說明紅景天苷是酒女貞子的主要藥效成分，故建議將紅景天苷作為酒女貞子含量測定的指標(biāo)成分。

表3 酒女貞子蒸制過程中各成分含量變化的相關(guān)性分析

《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版規(guī)定，酒女貞子蒸制時間為15～24 h[19]。本研究表明，女貞子酒蒸6～24 h 后，其外觀性狀符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標(biāo)準(zhǔn)，同時，紅景天苷含量隨酒蒸時間的增加而不斷升高，進(jìn)一步證實《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》2008 年版對女貞子酒蒸時間規(guī)定的科學(xué)性與合理性。

4 討論

本實驗基于前期研究基礎(chǔ)，研究酒女貞子在蒸制過程中外觀性狀及特女貞苷、紅景天苷、酪醇等6 個成分含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明隨蒸制時間的增加，酒女貞子顏色逐漸加深，酒蒸6～24 h的樣品符合《中國藥典》2015 年版酒女貞子性狀標(biāo)準(zhǔn)，蒸制時間超過12 h 時，酒女貞子的性狀不再發(fā)生明顯變化。6 個成分除蘆丁含量略有下降外，紅景天苷、酪醇的含量呈升高趨勢，特女貞苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量呈現(xiàn)下降趨勢，可見，酒女貞子與女貞子間成分含量差異顯著。而《中國藥典》2015年版并未對女貞子及酒女貞子的含量測定方法及限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行區(qū)分，難以體現(xiàn)女貞子酒制的炮制原理。因此，有必要重新建立酒女貞子含量測定的方法，從而規(guī)范炮制工藝、提升飲片質(zhì)量。關(guān)聯(lián)各成分含量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)每2 種成分含量變化均成強相關(guān)（P＜0.01），由于紅景天苷含量相對較高、活性強，且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，各批次女貞子及酒女貞子中特女貞苷的含量差異較大，故建議用紅景天苷替換特女貞苷作為酒女貞子含量測定的指標(biāo)成分。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論以藥物的外觀性狀認(rèn)知藥性，而藥物的功效則是對藥性的具體體現(xiàn)，現(xiàn)代中藥理論多以藥效物質(zhì)基礎(chǔ)即化學(xué)成分組成與含量確定藥物的作用[20]，古今分別通過外觀性狀和化學(xué)成分說明藥物的藥性、作用，可見，藥物的外觀性狀與其內(nèi)在成分存在一定相關(guān)性，通過炮制，藥物的外觀性狀達(dá)到古人要求的同時，其內(nèi)在成分也會發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)化，從而使得藥物發(fā)揮作用的側(cè)重有所不同。女貞子生用以“清虛熱”，酒制后則用以“補肝腎”。本研究發(fā)現(xiàn)，女貞子在酒制過程中外觀性狀、內(nèi)在成分均發(fā)生了顯著變化。目前，對于女貞子炮制過程中成分轉(zhuǎn)化機制的研究較多，關(guān)于其外觀性狀變化研究及外觀性狀變化與內(nèi)在成分間關(guān)聯(lián)研究的報道則相對較少。通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，女貞子酒制過程中顏色變化可能與其受熱發(fā)生美拉德反應(yīng)有關(guān)，美拉德反應(yīng)廣泛存在于食品加工及中藥炮制的過程中，其反應(yīng)過程主要為還原糖等羰基化合物和氨基酸等氨基化合物之間經(jīng)縮合、聚合等反應(yīng)生成類黑精等褐色物質(zhì)，是一種非酶褐變反應(yīng)，可導(dǎo)致食品或中藥色澤、香味等發(fā)生變化[21]。多糖、環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產(chǎn)生的小分子糖可為美拉德反應(yīng)提供豐富的底物，環(huán)烯醚萜苷水解生成的酚類化合物可增強體系酸性，從而加快美拉德反應(yīng)的速度[21]。此外，環(huán)烯醚萜苷類化合物水解產(chǎn)生的苷元可發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)，亦有可能導(dǎo)致女貞子酒制過程中顏色發(fā)生變化。綜上表明，女貞子酒蒸過程中的顏色變化與其多糖、環(huán)烯醚萜苷類等成分相關(guān)，后續(xù)可將顏色指標(biāo)量化，與多糖、環(huán)烯醚萜苷類等成分含量及美拉德反應(yīng)理化參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步闡釋女貞子酒制的炮制機制。