不同品系及生長期金線蓮的金線蓮苷含量變化研究△

陳瑩，王文義，諶賽男，黃錦芳，張雪，3，吳水生*，孫志蓉，陳菁瑛

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122；3.陸軍軍醫(yī)大學 西南醫(yī)院，重慶 400038；4.福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；5.福建省農(nóng)業(yè)科學院 藥用植物研究中心，福建 福州 350003

金線蓮又名金線蘭，為蘭科植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.的新鮮或干燥全草，是閩臺地區(qū)的珍稀草藥[1]，主產(chǎn)于福建，浙江、廣西、廣東等地亦有分布[2]，是福建省道地藥材，也是“福九味”之一[3]，被列為福建省野生藥材保護品種[4]。其性平，味甘，歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，具有清熱涼血、祛風利濕等功效[1]，臨床常用于治療乙型肝炎、腎炎、糖尿病、高血壓、手足口病等[5-7]。隨著藥用價值的開發(fā)和市場需求量的增加，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大。目前，金線蓮人工栽培技術成熟，市售藥材以組織培養(yǎng)種苗移栽林下土壤或大棚基質(zhì)種植4～6 個月或更長時間的栽培金線蓮為主[8-9]。金線蓮經(jīng)長期引種馴化和種質(zhì)選育，逐漸形成不同栽培品系，常見的有尖葉、本地野生、本地圓葉、大圓葉、紅霞等[3,10]。《福建省中藥材標準》2006 年版規(guī)定，金線蓮在夏、秋季莖葉茂盛時采收[1]，但各企業(yè)金線蓮種苗移栽時長和采收期不同，行業(yè)內(nèi)無統(tǒng)一的栽培技術規(guī)范[11]，加之金線蓮具有野生、不同栽培品系、組織培養(yǎng)等來源，其品質(zhì)參差不齊，有商家將組織培養(yǎng)種苗甚至同屬植物作為產(chǎn)品的加工原料，嚴重影響金線蓮產(chǎn)品的質(zhì)量[12-13]。

目前，尚未建立合適的標準對組織培養(yǎng)、不同栽培品系金線蓮的品質(zhì)進行質(zhì)量控制[14]。已有研究表明，金線蓮主要有效成分為黃酮及黃酮苷、金線蓮苷、多糖等[15-18]。金線蓮苷是從金線蘭中分離得到的糖苷類化合物，結(jié)構為五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳上連接葡萄糖，具有保護血管、降血糖、調(diào)血脂、抗肝病毒和保護肝細胞等作用[6,19]，是金線蓮的有效物質(zhì)及特征性成分，可作為金線蓮質(zhì)量評價的重要指標。已有研究表明，各品系金線蓮之間存在遺傳多樣性[3]，其總黃酮和核苷類成分含量也存在差異[20-21]。已有研究采用高效液相色譜法（HPLC）[22]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）[23]、超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜法（UPLCTOF-MS）[24]測定金線蓮中金線蓮苷的含量，但尚未見不同品系及生長期金線蓮中金線蓮苷含量變化比較的報道。本研究以不同產(chǎn)地不同品系及生長期的金線蓮為研究對象，建立HPLC-ELSD 測定金線蓮苷含量的方法，探究不同品系金線蓮在不同生長期金線蓮苷含量的變化規(guī)律，為金線蓮質(zhì)量評價、優(yōu)良種質(zhì)篩選及適宜采收期的確定提供參考。

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Alltech 3300 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國格雷斯奧泰公司）；GT-2120QTS 型超聲機（廣東固特超聲股份有限公司）；DV215CD 型十萬分之一分析天平（奧豪斯公司）；DFY-500A 型粉碎機（上海四瑞儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore公司）。

金線蓮苷對照品（批號：P08S8F43417，純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

不同品系及生長期金線蓮來源于福建漳州南靖、三明永安、莆田仙游等地。其中，組織培養(yǎng)金線蓮為組織培養(yǎng)生根階段4 個月的試管苗，由來源地金線蓮種植企業(yè)提供；栽培金線蓮為試管苗經(jīng)煉苗10～15 d后再移栽林下（永安、仙游）或大棚（南靖）種植樣品，并分別于種植1、2、3、4、5、6、7、9、10、13 個月取樣；野生金線蓮為林下野生藥材（表1）。所有樣品均為在產(chǎn)地隨機采集鮮品（50 株或以上），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院范世明高級實驗師鑒定為蘭科開唇蘭屬金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.的新鮮全草。

表1 金線蓮樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate HilicAmide（100 mm×4.6 mm,3 μm）；流動相為乙腈-水等度洗脫（92∶8，V/V）；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器霧化室溫度為50 ℃，載氣為高純氮氣，載氣流速為1.5 L·min-1；進樣量為10 μL。對照品與樣品的色譜圖見圖1。

圖1 金線蓮苷對照品與金線蓮HPLC圖

2.2 對照品溶液制備

精密稱取金線蓮苷對照品7.94 mg 到5 mL 量瓶中，加入甲醇制備成1.588 mg·mL-1的金線蓮苷對照品儲備液，備用。

2.3 供試品溶液制備

將60 ℃干燥至恒重的金線蓮粉碎，過60目篩得金線蓮粉末。取金線蓮粉末0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率250 W，頻率50 kHz），放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.4 線性關系考察

取2.2項下方法制備的對照品儲備液，分別用甲醇稀釋至1 588.00、1 270.40、1 016.32、508.16、254.08、127.04、63.52、31.76 μg·mL-1，精密吸取10 μL，按2.1 項下色譜條件測定峰面積，以質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標（X），以峰面積的對數(shù)值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.717 1X-1.599 8（r=0.999 8），線性范圍為31.76～1 588.00 μg·mL-1。按3 倍信噪比計算檢測限（LOD），按10倍信噪比計算定量限（LOQ），分別為15.88、31.76 μg·mL-1。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.4 項方法制備的508.16 μg·mL-1對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄金線蓮苷的峰面積，金線蓮苷峰面積RSD 為1.35%；精密吸取上述對照品溶液連續(xù)測定3 d，每天測定6次，金線蓮苷峰面積RSD為1.07%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取金線蓮樣品XYC3 粉末0.2 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1 項色譜條件下于0、2、6、10、12、24 h 進樣10 μL，被測物峰面積RSD為4.69%，結(jié)果表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

分別精密稱取同一批樣品XYC3 粉末0.2 g，共6 份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，測得金線蓮苷含量RSD 為2.15%，結(jié)果表明該法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取2.7 項下已知含量的樣品（XYC3）粉末，每份0.1 g，共6 份，精密稱定，每份精密加入相同量（已知含量的100%）的金線蓮苷對照品，按2.3 項下方法制備供試品溶液，在2.1 項下色譜條件下測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果該方法的加樣回收率為92.03%，RSD 為2.26%，說明該方法回收率良好（表2）。

表2 金線蓮中金線蓮苷加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 含量測定

分別取樣品粉末0.2 g，精密稱定，按2.3 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進行測定，用外標法計算樣品中金線蓮苷的含量，結(jié)果見表3。

由表3 可知，不同產(chǎn)地野生金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)為1.00%～11.04%，因產(chǎn)地不同而異。三明永安不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)為1.27%～5.54%，其含量大小由高到低為尖葉2＞本地圓葉1＞本地尖葉＞尖葉1＞本地圓葉2＞本地野生。三明永安林下移栽生長1～3 個月尖葉2栽培金線蓮的金線蓮苷含量變化為“升-降-升”，種植3 個月尖葉2 的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)達20.08%，紅霞栽培金線蓮的金線蓮苷含量表現(xiàn)出相似的規(guī)律，其種植6個月的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)為9.54%。

表3 金線蓮中金線蓮苷質(zhì)量分數(shù) %

南靖不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)為6.74%～16.14%，由大到小依次為大圓葉＞本地野生＞本地尖葉＞本地圓葉＞尖葉。南靖不同品系栽培金線蓮不同生長期的金線蓮苷含量見圖2。由圖2A 可知，本地野生金線蓮在1～4 個月生長期內(nèi)金線蓮苷含量均比尖葉和本地圓葉金線蓮高，表現(xiàn)為先升后降的趨勢，在生長3 個月時達到最高值21.97%；本地圓葉金線蓮的金線蓮苷含量在1～2個月時上升，在2～4 個月時下降，在生長2 個月時達到最高值18.61%；尖葉金線蓮在1～4 個月生長期內(nèi)金線蓮苷含量除了在3 個月時略微下降外均呈上升趨勢，在生長2、4 個月時質(zhì)量分數(shù)均達14.5%以上。由圖2B 可知，生長1～5 個月的大圓葉金線蓮的金線蓮苷含量呈現(xiàn)鋸齒狀“降-升-降-升”的趨勢，其質(zhì)量分數(shù)均在15%以上，分別在生長1、3 個月達到峰值21.29%、19.77%；本地尖葉金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)由1 個月時的20.72%緩慢下降到4 個月時的9.83%，到生長5 個月時上升到10.68%。此外，生長3～5 個月的紅霞金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)均在14.7%以上，在生長4個月時達16.1%。

圖2 南靖不同品系金線蓮在不同生長期的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)（,n=3）

仙游林下栽培4～13 個月的尖葉金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)見圖3。由圖3可知，尖葉金線蓮的金線蓮苷含量在生長4～7 個月時呈“升-降-升”的趨勢，并在生長7 個月時達到最高值17.22%。而在生長9 個月之后，其金線蓮苷含量呈下降趨勢，生長9～13 個月時其質(zhì)量分數(shù)為12.52%～17.04%。生長9 個月時含花苞金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)高于生長9 個月的開花金線蓮，分別為17.04%、15.17%，而生長10個月的開花金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)高于生長10 個月含花苞金線蓮，分別為14.61%、13.15%，但總體上進入花期及之后生長期的尖葉金線蓮的金線蓮苷含量較生長9 個月前降低。

圖3 仙游尖葉金線蓮在不同生長期的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)（n=3）

3 討論

3.1 金線蓮苷提取和測定方法的選擇

金線蓮苷是由1 個五元環(huán)內(nèi)酯與葡萄糖連接形成的苷，在酸堿性溶劑環(huán)境下易開環(huán)分解[23]，故本研究選擇操作簡便、提取效率高的超聲提取法[25]，減少中間操作步驟，保證金線蓮苷檢測的準確性。研究過程中比較了不同色譜柱（C18柱和氨基柱）、不同檢測器（二極管陣列檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器）對金線蓮苷保留、檢測的效果，金線蓮苷是強極性成分并為紫外末端吸收，應用C18柱出峰時間早且低波長下紫外吸收檢測干擾大，而應用氨基柱可以在適當?shù)臅r間出峰、分離度好，結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器測定干擾小。與Wei 等[26]研究結(jié)果一致，均表明HPLC-ELSD 適用于金線蓮苷成分快速、有效的測定。同時，選擇粒徑更小和柱長更短的氨基柱，可縮短單次樣品檢測時間，在10 min 內(nèi)即可完成目標成分測定。

3.2 含量比較

本研究首次對不同品系及生長期金線蓮的金線蓮苷含量進行測定，結(jié)果表明不同生長方式金線蓮的金線蓮苷含量差異較大，組織培養(yǎng)、栽培和野生金線蓮的金線蓮苷含量分別為1.55%～16.14%、2.68%～21.97%和1.51%～11.40%。野生金線蓮的金線蓮苷含量極差較大，可能與產(chǎn)地樣品種質(zhì)資源和自然生長時間不同有關；不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷含量與產(chǎn)地有關。南靖大圓葉組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分數(shù)最高，永安本地圓葉2 金線蓮質(zhì)量分數(shù)最低，可能是由于馴化引種的產(chǎn)區(qū)野生金線蓮種質(zhì)資源存在差異[4]。

同一產(chǎn)地不同品系栽培金線蓮的金線蓮苷含量在不同生長期變化趨勢不同。永安尖葉和紅霞金線蓮在移栽3 個月生長后期的金線蓮苷含量相對于前期均增加；南靖除尖葉金線蓮的金線蓮苷含量在1～4 個月生長期內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，其他4 種品系金線蓮的金線蓮苷含量隨生長期延長波動變化。其中，本地野生金線蓮的金線蓮苷含量在2～4 個月生長期內(nèi)均高于其他品系金線蓮，生長4 個月尖葉、本地野生和大圓葉金線蓮苷的含量均高于組織培養(yǎng)期，說明金線蓮的金線蓮苷含量與其品系和移栽生長時間有關。王海閣等[3]研究表明，大圓葉、小圓葉和尖葉金線蓮經(jīng)引種馴化已經(jīng)產(chǎn)生遺傳分化；楊彬彬[27]研究發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地不同生長階段金線蓮的金線苷含量隨種植時間增長而增加；結(jié)合本研究結(jié)果提示，金線蓮苷含量受種質(zhì)資源的影響較大，同時可能與不同生長期金線蓮苷生物合成量變化有關。此外，莆田仙游尖葉金線蓮的金線蓮苷含量進入花期之后呈下降趨勢，但其含量仍顯著高于生長4 個月的植株，說明在花期前延長種植時間有利于尖葉金線蓮的金線蓮苷含量的積累。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了HPLC-ELSD 測定金線蓮苷含量的方法，該方法準確、穩(wěn)定、重復性好，為金線蓮的質(zhì)量評價提供方法參考。不同品系及生長期金線蓮的金線蓮苷含量差異較大，影響較大的2 個因素是種質(zhì)資源和移栽生長時間。南靖不同品系金線蓮組織培養(yǎng)苗的金線蓮苷含量均較高，可考慮作為金線蓮苷分離提取的原材料；不同品系金線蓮的金線蓮苷含量隨移栽生長時間的變化趨勢不同，總體上栽培有利于金線蓮中金線蓮苷含量的積累；金線蓮苷含量較高的金線蓮品系有本地野生、大圓葉和尖葉。

致謝：福建省三明永安市金線蓮協(xié)會、福建省林業(yè)科技試驗中心陳翔提供不同品系及生長期的金線蓮樣品，馬來西亞理科大學（USM）任文輝指導本文撰寫。