3個桂花品種花瓣游離態和糖苷態香氣成分*

袁金梅 羅 靖 朱琳琳 席 婉 曾旭梅 熊康舜 王彩云 鄭日如

(1.華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室 武漢 430070； 2.農業農村部華中都市農業重點實驗室 武漢 430070)

香氣物質是植物中廣泛存在的次生代謝物，也是構成植物產品風味的關鍵因素(Dundarevaetal., 2013)， 在植物體內合成后存在3種形態，即釋放于空氣中的揮發態、貯存于植物內的游離態和糖苷態、其中糖苷態香氣物質是指香氣物質在糖基轉移酶的作用下通過糖苷鍵與糖類結合形成的無香味大分子化合物(Songetal., 2018; Wuetal., 2018)。游離態和糖苷態香氣物質可在植物產品的加工過程中通過加熱、酶解或酸解等方法釋放以提升風味，因此被認為是重要的香氣前驅體(Shojietal., 2015)。如葡萄(Vitisvinefera)中有高達80%的萜類香氣物質被糖基化(Friederickeetal., 2014a)，這些物質在葡萄酒發酵過程中可通過酶或酸的水解釋放，形成葡萄酒中麝香型香味(Cabritaetal., 2006; Parkeretal., 2018)。在茶葉中也存在類似的現象，茶樹(Camelliasinensis)新鮮葉片中所含的糖苷態芳樟醇、香葉醇和2-苯乙醇等在加工后釋放出來，成為烏龍茶和黑茶典型花香香型的主要來源(Shijoetal., 2015)。在香花植物中，已有梔子(Gardeniajasminoides)(董尚勝等， 2000)、玫瑰(Rosarugosa)(姚衛蓉等， 2007)、茉莉(Jasminumsambac)(黃新安等， 2009)和水仙(Narcissustazettavar.chinensis)(鐘嫻， 2014)等的糖苷類香氣化合物分離和鑒定。

桂花(Osmanthusfragrans)是中國傳統十大名花之一，被列為重要的天然保健植物和特產經濟植物(向其柏， 2008)。花香是桂花最重要的品質之一，香氣物質(劉玉蓮)的種類和變化規律一直是研究的熱點(Heetal., 2017； Fuetal., 2017； Hanetal., 2019)。前期研究表明，桂花鮮花中包含六大類揮發態香氣物質，其中萜類、C6化合物和酮類相對含量較高(Fuetal., 2019)。進一步通過氣相色譜嗅聞技術(gas chromatography-olfactometry，GC-O)進行了特征香氣物質鑒定，結果表明桂花中存在17種香氣活性成分，除γ-萜品烯、丁酸葉醇酯和丁酸己酯外，其余14種均為單萜類化合物，包括紫羅酮、芳樟醇、羅勒烯及其衍生物(田懷香等， 2014； 鄒晶晶等， 2017； Caietal., 2014)。在桂花鮮花中加入β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)后，花瓣可釋放出大量香氣物質(楊志萍等， 2005)。桂花中積累的游離態和糖苷態香氣物質可能成為具有開發價值的香氣資源庫，但其種類及其變化規律尚不明晰。桂花根據花色分為丹桂、金桂和銀桂品種群，其揮發態香氣物質具有顯著差別(鄒晶晶等， 2017)。本研究選取了3個典型且常見的品種‘晚銀桂’、‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’進行游離態和糖苷態香氣物質的檢測，旨在明確不同品種游離態和糖苷態香氣物質的變化規律，為桂花的產業應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以華中農業大學校園內長勢良好的典型品種‘晚銀桂’、‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’為材料，2019年9月在陰天上午9： 00—10： 00分別采取花瓣未展(S1)、花瓣半展開(S2)、花瓣完全展開(S3)和花瓣枯萎(S4)4個時期的花瓣迅速置于液氮速凍并在-80 ℃冰箱貯存備用。每次稱取2 g花瓣進行香氣提取，每組樣品進行3個重復。

1.2 試劑及儀器

試劑及儀器β-D-葡萄糖苷酶、環己酮色譜純購置于美國Sigma公司、C8-C20正構烷烴標準品購置于美國Fluka公司，戊烷、乙醚、甲醇等色譜純試劑購置于美國Mreda公司，AmberliteXAD-2樹脂柱購置于美國Supelco公司。檢測儀器為Thermo DSQⅡ單四極桿氣相色譜-質譜聯用儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離態香氣物質提取 2 g花瓣采用液氮研磨后加入戊烷/乙醚(1∶1)在16 ℃下提取30 min，重復提取1次后將混合提取液用氮氣吹干儀濃縮至2 mL。加入內標環己酮946 μg，并用無水硫酸鈉干燥，最后用尼龍膜過濾轉移至萃取瓶。

1.3.2 糖苷態香氣物質提取 2 g花瓣采用液氮研磨后加入蒸餾水，4 ℃低溫離心15 min。取上清液過濾后以3 mL·min-1的流速經過Amberlite XAD-2離子交換樹脂吸附柱(15 mm×25 mm)，然后用40 mL去離子水過柱以去除糖、酸物質，用40 mL戊烷/乙醚(1∶1)去除游離態香氣物質，接著用20 mL甲醇洗脫吸附柱上的糖苷態物質，洗脫液在旋轉蒸發儀上濃縮至干燥。用2 mL 200 mmol·L-1檸檬酸和200 mmol·L-1磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)溶解，再用1 mL戊烷/乙醚(1∶1)3次萃取以去除殘留的游離態香氣物質，水相備用。在2 mL水溶液中加入300 μL β-D-葡萄糖苷酶(≥6 U·mg-1)，10 μL環己酮作為內標(濃度為9.46 mg·mL，溶于甲醇)，再覆蓋1 mL MTBE，將反應液放入萃取瓶中。在40 ℃水浴中保溫水解36 h，之后用1 mL MTBE 3次萃取酶解液，無水硫酸鈉干燥，氮吹濃縮至0.5 mL，供GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS檢測 按照劉偲(2015)設置條件進行，GC-MS檢測所得質譜圖與NIST譜庫比對，同時根據科瓦茨保留指數(Kovats’ Retention Indices，RI)和文獻進一步確認香氣種類。保留指數由相同升溫程序下正構烷烴標準樣品(C8-C20)計算得到。游離態香氣與糖苷態香氣物質采用內標法進行定量。香氣物質的定量分析采用內標法，香氣各組分的含量(μg·g-1)=各組分的峰面積/內標物的峰面積×內標物含量(μg)/樣品量(g)×f(f為各組分對內標物的校正因子，f=1)。

1.4 數據統計與分析

每個樣品進行3個生物學重復試驗，計算平均值和標準誤，同時采用SPSS軟件的單因素方差分析(one-wayANOVA)統計數據差異。

2 結果與分析

2.1 3個品種花瓣完全展開期(S3)游離態和糖苷態萜類香氣物質比較

萜類化合物是桂花最為重要的特征香氣物質，是決定桂花香味濃郁度和香型的決定性因素。這類物質不僅廣泛存在于揮發態香氣物質中，還以游離態和糖苷態形式大量貯存于植物組織內。3個品種的游離態和糖苷態萜類香氣物質包括單萜、單萜醇、單萜酮和單萜氧化物四大類。游離態和糖苷態中均存在的香氣物質包括芳樟醇、芳樟醇氧化物、二氫-β-紫羅酮和4-羥基-β-紫羅酮等，說明部分游離態香氣物質可直接轉化為糖苷態香氣物質。同時，游離態和糖苷態成分也有明顯差別，游離態中特有單萜類物質D-檸檬烯、順式-β-羅勒烯，單萜酮α-紫羅酮和香葉基丙酮，單萜醇2,6-二甲基-1,7-辛二烯-2,6-二醇和2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3,6-二醇； 而糖苷態特有大分子單萜衍生物，包括8-羥基芳樟醇、3-氧代-α-紫羅醇、二氫-3-氧代-β-紫羅醇、2,4,4-三甲基-3-(3-氧代丁基)環己烯-2酮。由此可見，單萜類物質經過氧化、羥基化等反應后更易發生糖苷態轉化。

3個桂花品種花瓣完全展開期(S3)的游離態萜類香氣物質的成分相近，但其含量差異顯著(表1)。其中‘潢川金桂’的游離態萜類香氣物質最高，達到254.03 μg·g-1FW，是含量最低的‘橙紅丹桂’的3.8倍。在游離態物質中單萜含量最低，單萜醇和單萜氧化物含量相近，單萜酮的含量較高。‘晚銀桂’和‘潢川金桂’的游離態萜類物質種類基本一致，與‘橙紅丹桂’差異最大的為單萜酮。‘晚銀桂’和‘潢川金桂’具有4種游離態單萜酮，包括香葉基丙酮、α-紫羅酮、二氫-β-紫羅酮和反式-β-紫羅酮，總含量分別達到135.51和104.19 μg·g-1FW； ‘橙紅丹桂’僅有1種游離態單萜酮反式-β-紫羅酮，含量僅為13.08 μg·g-1FW。3個品種的游離態單萜氧化物均為芳樟醇氧化物，其中含量最豐富的為8-羥基芳樟醇。

表1 桂花‘晚銀桂’、‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’花瓣完全展開期(S3)游離態萜類香氣物質種類與含量①Tab.1 The volatile components categories and their contents in the full-blossoming period(S3)of Osmanthus fragrans ‘Wan Yingui’, ‘Huangchuan Jingui’ and ‘Chenghong Dangui’

由表2可知，糖苷態萜類香氣物質僅有單萜醇、單萜酮和單萜氧化物三類，與游離態相比缺少了單萜類物質。3個品種的游離態萜類香氣成分基本一致但含量差異顯著。糖苷態萜類香氣物質含量最高的為‘晚銀桂’，可達378.1 μg·g-1FW，是含量最低的‘橙紅丹桂’的2.19倍。在‘晚銀桂’和‘潢川金桂’中含量最高的物質為單萜酮，最低的物質為單萜氧化物； 而在‘橙紅丹桂’中正相反。與游離態物質規律相似，‘晚銀桂’和‘潢川金桂’中均富含紫羅酮及其衍生物，顯著高于‘橙紅丹桂’，其中‘晚銀桂’中的糖苷態4-羥基-β-紫羅酮高達186.43 μg·g-1FW。‘橙紅丹桂’中糖苷態芳樟醇及其衍生物含量為99.78 μg·g-1FW，而‘晚銀桂’和‘潢川金桂’僅有15.56和15.25 μg·g-1FW。由此可見，在‘潢川金桂’和‘晚銀桂’中的非揮發態類胡蘿卜素裂解產物紫羅酮及其衍生物顯著高于‘橙紅丹桂’； 相反，‘橙紅丹桂’中的非揮發態芳樟醇及其衍生物顯著高于‘潢川金桂’和‘晚銀桂’。這與揮發態規律相似，類胡蘿卜素是否發生裂解是導致品種間香氣差異的重要因素。

表2 桂花‘晚銀桂’、‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’花瓣完全展開期(S3)糖苷態萜類香氣物質種類及含量Tab.2 The glycosylated volatile categories and their contents in the full-blossoming period(S3) of O. fragrans ‘Wan Yingui’, ‘Huangchuan Jingui’,and‘ChenghongDangui’

2.2 3個桂花品種花瓣開放過程中游離態和糖苷態香氣物質變化規律

3個品種的游離態物質包括單萜、單萜醇、單萜酮、單萜氧化物、芳香族類化合物、酯類、烷烴類和其他香氣物質等8類(圖1A，C，E)； 糖苷態物質包括單萜醇、單萜酮、單萜氧化物、芳香族類化合物、酯類和其他香氣物質等，缺少單萜和烷烴類物質(圖1B，D，F)。從含量來看，3個品種的糖苷態香氣物質含量顯著高于游離態香氣物質。‘晚銀桂’‘潢川金桂’‘橙紅丹桂’的花瓣完全展開期(S3)糖苷態香氣物質含量分別達到683.75、698.78、582.47 μg·g-1，高于相應的游離態香氣物質50.68%、60.81%、94.27%。3個品種的游離態香氣物質含量均先升高后降低，在花瓣半展開期(S2)或完全展開期(S3)達到最大值(圖1A，C，E)； 3個品種的糖苷態香氣物質含量則逐步升高，在花瓣枯萎期(S4)積累量達到最大值。‘晚銀桂’中的游離態香氣物質最為豐富，‘潢川金桂’中糖苷態香氣物質最為豐富(圖1)。

圖1 3個桂花品種不同花期游離態和糖苷態香氣物質變化規律Fig. 1 Variation of free and glycosylated aroma compounds in three O. fragrans cultivars at different blossoming periods‘晚銀桂’游離態(A)和糖苷態(B)香氣物質，‘潢川金桂’游離態(C)和糖苷態(D)香氣物質，‘橙紅丹桂’游離態(E)和糖苷態(F)香氣物質。S1: 花瓣未展期； S2： 半展期； S3： 完全展開期； S4： 枯萎期。不同小寫字母表示同類香氣物質在不同花期的差異顯著性(P<0.05)。每個樣品3個生物學重復。Free(A) and glycosylated(B) aroma compounds in ‘Wan Yingui’, free(C) and glycosylated(D) aroma compounds in ‘Huangchuan Jingui’, free(E) and glycosylated(F) aroma compounds in ‘Chenghong Dangui’. S1： The flowers of not blossoming period; S2: Initial blossoming period; S3: Full blossoming period; S4: Late blossoming period. Different small letters indicate significant difference at 0.05 level between the same type of aroma compounds from different blossoming periods. Each sample contains three biological repeats.

在游離態香氣物質中，3個品種的單萜及其衍生物比例均明顯高于其他香氣物質，如‘晚銀桂’中的單萜類物質在花瓣完全展開期(S3)占所有香氣物質的42.66%，而酯類和芳香族化合物僅為24.85%和12.99%(圖1A)。除了單萜類物質以外，游離態中含有豐富的酯類香氣物質，尤其是桂花特征香氣物質γ-癸內酯，在‘晚銀桂’‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’花瓣完全展開期(S3)含量分別達到54.68、75.1和73.15 μg·g-1FW，而在糖苷態物質中則僅能檢測到微量酯類香氣物質。

在糖苷態香氣物質中，3個品種的香氣組分有顯著差異(圖1B，D，F)。其中‘晚銀桂’的單萜及其衍生物占花瓣枯萎期(S4)所有香氣的比值高達53.6%，而‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’僅有35.61%和35.88%。在‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’中，比例最高的香氣物質為芳香族類化合物，該類物質具有典型的苯環結構，結構穩定，不易分解且毒性較強。芳香族類化合物主要包括4-羥基-苯乙醇、苯氧基-2-(1,1-二甲基乙基)-3-甲基、2,4-雙(1,1,-乙基)-苯酚等，含量最高的4-羥基苯乙醇在‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’的花瓣完全展開期(S3)中可高達341.35、255.85 μg·g-1FW。

3 討論

3.1 桂花游離態、糖苷態香氣物質與揮發態香氣物質的關系

香味物質合成后會以揮發態的形式釋放或以游離態和糖苷態的形式貯藏(Songetal., 2018)。揮發態香氣物質可以有效吸引昆蟲授粉(Mollyetal., 2016)，但是部分香氣物質對植物本身有一定的毒性(Raguso， 2016; Songetal., 2018)，因此也可以無害的糖苷態形式貯存起來，對病菌和食草動物等起到間接防御作用(Junkeretal., 2011)。

本研究對7個桂花品種進行揮發態、游離態和糖苷態香氣物質的檢測表明，游離態香氣物質與揮發態香氣物質成分基本一致，但是在糖苷態中檢測到4-羥基苯乙醇、順式8-羥基芳樟醇等20種特有香氣物質，并且這些物質在其他桂花香氣研究中鮮有報道(曹慧等， 2009； 侯丹， 2015； Xinetal., 2013； Fuetal., 2019)。糖苷態香氣物質中大量單萜類物質在細胞色素P450這類末端加氧酶的作用下發生氧化、環化、羥化等反應，形成一系列大分子衍生物，如各類芳樟醇氧化物、4-羥基-β-紫羅酮、3-氧代-α-紫羅醇、二氫-3-氧代-β-紫羅醇等(Boachonetal., 2015)。雖然萜類衍生物的揮發性減弱，但是易在糖基轉移酶的作用下與糖基結合形成糖苷態化合物。

3類香氣物質在花瓣開放過程中呈現緊密的關聯。揮發態香氣物質從花瓣半展開期(S2)至完全展開期(S3)顯著增加，在花瓣枯萎期(S4)明顯下降(Zengetal., 2015; Zhengetal., 2017)； 這與游離態香氣物質變化規律相似，但糖苷態香氣物質呈現持續增長的趨勢，在花瓣枯萎期(S4)達到峰值(表1，表2，圖1)。以芳樟醇及其衍生物為例，‘橙紅丹桂’中含量較高的糖苷態香氣物質順式-8-羥基芳樟醇和反式-8-羥基芳樟醇在開花末期的糖苷化比例高達92.08%和89.54%(Zengetal., 2016)。在葡萄、柑橘(Citrus)、番茄(Solanumlycopersicum)等的研究中也發現果實成熟前香氣物質主要以揮發態形式釋放，果實成熟后大量香氣物質轉化為糖苷態形式積累(Simonaetal., 2009; D’Onofrioetal., 2017)。另外，對桂花香氣的晝夜節律研究表明，揮發態香氣物質從上午開始顯著升高，至中午12:00釋放量達到峰值，之后持續下降； 而游離態則會持續增加至18:00，隨后下降； 糖苷態香氣物質則持續增長至夜間(Zhengetal., 2017)。在大馬士革玫瑰(Rosadamascena)中也有類似現象，2-苯基乙醇的釋放主要受到糖苷態轉化的影響(Piconeetal., 2004)。在中華獼猴桃(Actinidiachinensis)花中芳樟醇的含量也明顯受到糖苷化8-羥基芳樟醇的調控(Greenetal.， 2012)。將芳樟醇合酶基因在矮牽牛(Petuniahybrida)花中或番茄果實中超表達后，除了顯著增加揮發態芳樟醇外，還明顯提高了糖苷態8-羥基芳樟醇的含量(Lewinsohnetal., 2001； Luckeretal.,2001)。以上現象說明，3種形態香氣物質存在相互轉化和相互影響的關系。

在植物的次生代謝中糖基化現象非常普遍，糖基轉移酶可將活性糖基與香氣、色素等大量配基相結合，從而改變這些小分子化合物的生物化學性質(B?nischetal., 2014)。早在1980年研究者就已明確糖基化反應能顯著改變花朵和果實香味(Williamsetal.， 1980)，但直到近期才在基因組、轉錄組和代謝組研究的基礎上在葡萄(Friederickeetal., 2014a； 2014b)、桃(Prunuspersica)(Wuetal., 2018)、美味獼猴桃(Actinidiadeliciosa)(Yar-Khingetal., 2014)、茶葉(Shojietal., 2015; Songetal., 2018)、桂花(Zhengetal.， 2019)等植物中鑒定到部分作用于香氣物質的糖基轉移酶。在桂花中挖掘特異催化萜類香氣物質的糖基轉移酶基因并明確其基因功能和酶學特性，將是深入解析糖基化反應內在分子機制的關鍵，也是進行花香品質調控的重要前提。

3.2 3個桂花品種香氣物質的差異

3個品種游離態和糖苷態香氣物質的種類相似，但是含量存在較大差異。總體來說，‘晚銀桂’和‘潢川金桂’的游離態和糖苷態香氣物質含量要明顯高于‘橙紅丹桂’。‘晚銀桂’中的單萜及其衍生物含量最高，而‘潢川金桂’和‘橙紅丹桂’則富含大量酯類物質。單萜及其衍生物是重要的香氣活性物質，其組分決定了植物組織的香型和香味濃郁度(Caietal.,2014； Wangetal., 2009)。‘晚銀桂’和‘潢川金桂’的揮發態、游離態和糖苷態香氣物質中均富含反式-β-紫羅酮、α-紫羅酮、二氫-β-紫羅酮等類胡蘿卜素裂解產物，呈現紫羅香、木香和果香特質； 而‘橙紅丹桂’的揮發態、游離態和糖苷態香氣物質主要以反式芳樟醇氧化物(呋喃型)、順式芳樟醇氧化物(呋喃型)、8-羥基芳樟醇、反式-β-羅勒烯、芳樟醇等單萜和單萜氧化物為主，呈現花香、青草香等特質(Caietal., 2014)。從合成路徑上來看，紫羅酮及其衍生物主要是通過類胡蘿卜素裂解酶OfCCD1、OfCCD4裂解類胡蘿卜素而產生(Baldermannetal., 2010)； 芳樟醇、羅勒烯及其衍生物等則是由香葉基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)經萜烯合成酶催化產生(Dundarevaetal., 2013； Zengetal., 2016)。兩者的反應底物均來源于2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途徑，可能是由于不同品種在MEP分支途徑上的不同流量分配導致了香氣差異。

3.3 桂花游離態和糖苷態香氣物質的產業價值

與揮發態香氣物質相比，游離態和糖苷態物質貯存在植物組織內，容易在加工過程中釋放出來，成為產品的風味物質(Parkeretal., 2018)。有機溶劑萃取法是進行香味物質提取的常規步驟。通過多種有機溶劑的萃取比較研究，筆者發現戊烷和乙醚可有效提取桂花中的香氣活性物質單萜及其衍生物(劉偲， 2015)。另外，采用β-葡萄糖苷酶或復合酶AR-2000水解法可有效釋放貯存在花瓣中的香氣物質(楊志萍等， 2005； Yar-Khingetal., 2014)。

在游離態香氣物質中，3個品種均含有豐富的酯類物質γ-癸內酯，它能呈現強烈的果香味。同時，3個品種的游離態和糖苷態香氣中含有大量單萜及其衍生物，這些特征香氣物質不僅是鮮花的主要香氣成分，也是桂花產品中的重要香氣活性物質，其種類和含量對香型和香味濃郁度均起到重要作用(Wangetal., 2009； Xinetal., 2013)。其中紫羅酮及其衍生物呈現紫羅香、木香和果香特質，芳樟醇氧化物、反式-β-羅勒烯等則呈現花香、青草香等特質(Caietal., 2014)。香葉基丙酮則是具有木蘭香氣的名貴香料，廣泛應用于日化、食品和醫藥行業(孫美環等， 2013)。與揮發態和游離態香氣相比，4-羥基苯乙醇是桂花糖苷態中含量最高的組分，屬于芳香族醇類物質，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(李軍等， 2008)。綜上所述，桂花除了揮發態香氣物質以外，在游離態和糖苷態中均含有極富應用潛力的香氣物質，通過酶解和萃取的方法對其進行提取和釋放可以有效提升花卉產品的香味品質。

4 結論

本研究解析了游離態和糖苷態香氣的提取和檢測方法，表明有機溶劑戊烷和乙醚可以有效提取萜類香氣物質，β-D-葡萄糖苷酶可以有效裂解糖苷鍵，促進糖苷態香氣物質的釋放。香氣鑒定表明，3個品種的桂花中均含有豐富的萜類及其衍生物、芳香族化合物、酯類等非揮發態香氣活性物質，其中在揮發態香氣中未檢測到的香葉基丙酮和4-羥基苯乙醇在非揮發態中大量存在，且均是有利用價值的香氣物質。因此，游離態和糖苷態香氣物質可以在各種桂花加工品中加以應用，提升香味品質。