黃腐酸與微生物菌劑協同對煙草青枯病及根際土壤細菌群落的影響

施河麗，向必坤，左 梅，彭五星，尹忠春，王 瑞，譚 軍*

1.湖北省煙草公司恩施州公司煙葉科技中心，湖北省恩施市市府路65 號 445000

2.湖北省煙草公司恩施州公司宣恩縣煙葉分公司，湖北省宣恩縣建設路36 號 445500

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種易感染、傳播快、危害極大的土傳細菌性病害［1-2］。煙草青枯病的發生是多種因素相互影響、相互作用的結果，長期連作及化學肥料的大量使用導致土壤出現嚴重退化是引起煙草青枯病大面積發生的根本原因，具體表現為土壤板結、酸化嚴重、養分供應失調、物理性狀變差、微生態環境失衡等［3-5］。土壤微生態是個復雜的系統，土壤、微生物和植物3 者均可對土壤中微生物的組成、數量、群落結構及相互作用等造成影響。研究表明，土壤微生物多樣性、群落結構和微生物種群間相互作用的改變顯著影響植物健康［6-7］，可通過施用微生物菌劑調控土壤微生態，改善土壤環境，進而達到對土傳病害的有效防治［8］。黃腐酸作為土壤改良劑，是土壤中最好的腐殖酸成分，也是形成土壤團粒結構的核心物質［9］，有改善土壤理化性質，提高土壤肥效，促進植物生長，增強植物抗逆性，增加產量的作用［10］，已被廣泛應用于小麥、玉米、棉花等多種作物的種植中［11-12］。黃腐酸有羥基、羧基、苯羧酸等基團，這與一些苯氧羧酸類、酚類農藥的有效成分相同，具有一定的抑菌抗病毒作用［13］，可為有益微生物菌群創造良好的生存環境。因此，通過施用黃腐酸可實現某些植物病害的防控。Afifi 等［14］發現，噴施濃度為150 mg/L 黃腐酸顯著降低了黃瓜枯萎病病原體生長速度和病害的嚴重程度；Giovanardi等［15］研究表明，黃腐酸可用于桃潰瘍病的防治，并且可促進土壤中微生物群落的發育；趙世元［16］研究表明，大田噴施10 mmol/L 的黃腐酸60 d 后仍對煙草青枯病有較好的防控效果，其相對防效可達35.64%。然而，關于黃腐酸與微生物菌劑協同應用于煙草青枯病防治的研究則鮮見報道，其對煙株根際土壤細菌群落的影響也不明確。本文中通過研究黃腐酸與微生物菌劑協同對煙草青枯病的防治效果及對根際土壤細菌群落的影響，旨在為土壤改良劑和微生物菌劑能更廣泛地應用于煙草青枯病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗于2019 年在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮鑼圈村8 組進行。土壤類型為恩施煙區具有代表性的山地黃棕壤，土壤質地為壤土。試驗開始前耕層（0～20 cm）土壤的基本理化性質：土壤pH 5.37（水土體積比2.5∶1）、有機質26.72 g/kg、堿解氮149.11 mg/kg、有效磷24.73 mg/kg和速效鉀109.58 mg/kg。

1.2 試驗材料

供試烤煙品種為云煙87。供試黃腐酸為褐色粉狀，有機質、黃腐酸和氨基酸含量（質量分數，下同）分別為≥60%、45%和6%，pH 5.0～6.0，N、P2O5和K2O 含量分別為3%、0.5%和12%。供試微生物菌劑為防治煙草青枯病的復合芽孢桿菌，規格為100 g/袋，有效活菌數≥2×108CFU/g。

1.3 試驗設計

共設置4 個處理，包括MT1（對照）：清水；MT2：微生物菌劑1.5 kg/hm2；MT3：微生物菌劑1.5 kg/hm2+黃腐酸22.5 kg/hm2；MT4：黃腐酸22.5 kg/hm2。隨機區組排列，3 次重復，共計12 個小區。每小區5 行，行距1.20 m，株距0.55 m，每行種煙12 株。

按當地常規施肥：有機肥（N、P2O5和K2O 含量分別為1.0%、1.5%和2.5%）900.0 kg/hm2，煙草專用復合肥（N、P2O5和K2O 含量分別為8.0%、16.0%和24.0%）900.0 kg/hm2，磷肥（P2O5含量為12.0%）375.0 kg/hm2，硝銨磷肥（N 和P2O5含量分別為30.0%和6.0%）67.5 kg/hm2，硫酸鉀（K2O 含量為50%）150.0 kg/hm2。有機肥、煙草專用復合肥和磷肥作為底肥，硝銨磷肥作為提苗肥，硫酸鉀作為追肥；4 月5 日施肥后起壟；4 月28 日移栽。

移栽后25 d，MT1 處理中將清水按0.1 kg/株，淋至根部；MT2 處理中將微生物菌劑按0.6 kg/hm2兌水1 500 kg，每株煙0.1 kg，淋至根部；MT3 處理中將微生物菌劑按0.6 kg/hm2和黃腐酸按9 kg/hm2混合兌水1 500 kg，每株煙0.1 kg，淋至根部；MT4處理中將黃腐酸按9 kg/hm2兌水1 500 kg，每株煙0.1 kg，淋至根部。然后圍兜、封口。

移栽后40 d，MT1 處理中將清水按0.15 kg/株；MT2 處理中將微生物菌劑按0.9 kg/hm2兌水2 250 kg，每株煙0.15 kg；MT3處理中將微生物菌劑按0.9 kg/hm2和黃腐酸按13.5 kg/hm2混合兌水2 250 kg，每株煙0.15 kg；MT4 處理中將黃腐酸按13.5 kg/hm2兌水2 250 kg，每株煙0.15 kg；以上處理均在離煙株3～5 cm 處打15 cm 深的孔施入。

1.4 試驗方法

1.4.1 田間病害調查

按照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》［17］調查每個小區的發病株數及發病等級，計算發病率和病情指數。根據青枯病的發生情況，煙苗移栽后每隔30 d 調查1 次，連續調查4次以上。發病率和病情指數計算公式如下：

1.4.2 田間取樣

2019 年9 月中旬，煙葉采收結束后，按S 型五點采樣法，每小區選取5 株煙，去掉0～2 cm 表層土壤，挖出煙株根系，去除較大土壤團塊，收集附著在煙株根系表面0～4 mm 的土壤，混合均勻后放入自封式取樣袋中，帶回實驗室置于－80 ℃冰箱保存。

1.4.3 土壤微生物高通量測序分析

對土壤樣品的基因組DNA 進行提取，以稀釋后的基因組DNA 為模板，采用引物515F（5′-GTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3′），806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）對16S V4 區進行擴增。PCR 擴增產物經2%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后使用德國Qiagen 公司的膠回收試劑盒回收目的條帶產物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（美國Illumina 公司）建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000（美國Illumina 公司）進行上機測序。本研究中的樣品基因組DNA 的提取、PCR 擴增、PCR 產物的混樣和純化、文庫構建、NovaSeq 上機測序和生物信息分析均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4.4 數據處理

首先對原始數據用FLASH 軟件（Version 1.2.7）拼接、Qiime 軟件（Version 1.9.1）過濾、VSEARCH 軟件去除嵌合體后，得到最終的有效數據。利用Uparse 軟件對所有樣本的全部有效數據進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units，操作分類單元）。對OTUs 序列進行物種注釋，用Mothur 法與SILVA132［18］的SSUrRNA 數據庫［19］進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計算觀測物種數（Observed_species）、文庫覆蓋率（Goods_coverage）、Chao 1 指數、ACE 指數、香農指數（Shannon index）、辛普森指數（Simpson index）等多樣性指數；使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制韋恩（Venn）圖、主坐標分析（PCoA）圖；使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計算Unifrac 距離、構建UPGMA 聚類樹［20］；使用Excel 2010 軟件對相對豐度數據進行統計分析，繪制相對豐度柱狀圖；LEfSe 分析［21］時使用LEfSe 軟件，默認設置LDA Score 的篩選值為4；部分表格數據整理與分析采用Excel 2010 及SPSS Statistics 22.0 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 黃腐酸與微生物菌劑協同對煙草青枯病的防效

不同處理的煙草青枯病發病情況如表1 所示，煙草青枯病在移栽60 d 后開始出現，移栽90 d 后進入盛發期，移栽120 d 后達到高峰。移栽60 d 和90 d 后，煙草青枯病發病率和病情指數在不同處理間差異不顯著；移栽120 d 后，MT2、MT3 和MT4處理的煙草青枯病發病率和病情指數均顯著低于MT1 處理，其中MT3 處理的發病率和病情指數最低，較MT1 處理分別降低了49.32%和64.00%。從圖1 可以看出，移栽120 d 后，MT1 處理的煙株已無煙葉可以采收，而MT2、MT3 和MT4 處理煙株的中上部葉片還可繼續采收，其中MT3 處理的可采煙葉數最多。表明黃腐酸與微生物菌劑協同對煙草青枯病有較好的防治效果。

圖1 田間煙株生長情況（移栽后120 d）Fig.1 Growth states of tobacco plants in fields（120 d after transplanting）

表1 不同處理的煙草青枯病發病情況①Tab.1 Incidence of tobacco bacterial wilt under different treatments

2.2 黃腐酸與微生物菌劑協同對根際土壤細菌群落的影響

2.2.1 不同處理的根際土壤細菌群落OTU 特異性分析

對不同處理的根際土壤細菌群落（圖2）比較發現，MT1、MT2、MT3 和MT4 處理的共有OTUs數量為2 524 個，MT2、MT3 和MT4 處理較MT1 處理OTUs 總數分別增加了2.28%、13.30% 和12.02%，其中以MT3 處理OTUs 總數增加最多；MT1、MT2、MT3 和MT4 處理特有OTUs 數量分別為155、181、334 和274 個，分別占各處理樣本OTUs 總數的4.12%、4.71%、7.84%和6.51%，其中以MT3 處理特有OTUs 數量最多、占比最大。表明黃腐酸與微生物菌劑協同可增加根際土壤細菌群落OTUs 總數和特有OTUs 數量。

圖2 不同處理的根際土壤細菌群落韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial community in rhizosphere soil under different treatments

2.2.2 不同處理的根際土壤細菌群落多樣性

2.2.2.1 α多樣性

對不同處理根際土壤細菌群落進行6 種α多樣性指數計算，由表2 可知，觀測物種數（Observed_species）、香農指數（Shannon index）和辛普森指數（Simpson index）在不同處理間差異達到顯著水平。MT3 處理的觀測物種數、香農指數和辛普森指數顯著高于MT1 處理，較MT1 處理分別增加了13.60%、8.37%和0.61%；MT3 處理的香農指數和辛普森指數顯著高于MT2 處理，較MT2處理分別增加了6.86%和0.61%。MT4 處理的香農指數和辛普森指數顯著高于MT1 處理，較MT1處理分別增加了6.27%和0.51%；MT4 處理的香農指數和辛普森指數顯著高于MT2 處理，較MT2 處理增加了4.79%和0.51%。α多樣性分析結果表明，黃腐酸與微生物菌劑協同可顯著提高根際土壤細菌群落的多樣性。

表2 不同處理的根際土壤細菌群落α多樣性指數Tab.2 Alpha diversity indexes for bacterial in rhizosphere soil under different treatments

2.2.2.2 β多樣性

基于Weighted Unifrac 距離對樣品進行主坐標分析（PCoA），以了解根際土壤細菌群落結構的變化。由圖3 可知，第一主坐標成分（PC1）和第二主坐標成分（PC2）的貢獻率分別為59.96%和21.09%，累計貢獻率達81.05%。不同處理的樣本點在PC 軸上分布有差異，MT1 和MT2 處理的樣本點在主坐標分析圖中的距離較接近，表明MT1 和MT2 處理的物種組成較為相似。

圖3 不同處理下根際土壤細菌群落多樣性的主坐標分析Fig.3 PCoA analysis of bacterial community in rhizosphere soil under different treatments

以Weighted Unifrac 距離矩陣做UPGMA 聚類分析，對不同處理進行等級聚類（圖4），發現MT1和MT2 處理的各菌群豐度與MT3 和MT4 處理的各菌群豐度被聚類為2 個分支，表明黃腐酸與微生物菌劑協同對根際土壤各菌群的豐度有較大影響。

圖4 不同處理的UPGMA 聚類樹（門水平）Fig.4 UPGMA clustering tree under different treatments（phylum level）

2.2.3 不同處理的根際土壤細菌群落結構分析

物種相對豐度前10 位的細菌門見圖5，各處理均以變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）為主要菌門，其相對豐度總和分別占各處理的83.51%（MT1）、83.03%（MT2）、80.05%（MT3）和82.06%（MT4）。物種相對豐度前10 位的細菌屬見圖6，Chujaibacter屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）為各處理根際土壤的優勢菌屬，其相對豐度總和分別占各處理的27.63%（MT1）、27.91%（MT2）、15.47%（MT3）和20.36%（MT4）。使用LEfSe 分析不同處理根際土壤細菌群落中主要差異物種（P<0.05，LDA Score>4）（圖7），在門水平上，變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門的相對豐度分別在MT2、MT3 和MT4 處理的根際土壤中顯著增加；在屬水平上，Chujaibacter屬的相對豐度在MT1 處理根際土壤中顯著增加。

圖5 不同處理下根際土壤細菌群落的相對豐度（門水平）Fig.5 Relative abundance of bacterial community in rhizosphere soil under different treatments（phylum level）

圖6 不同處理下根際土壤細菌群落的相對豐度（屬水平）Fig.6 Relative abundance of bacterial community in rhizosphere soil under different treatments（genus level）

圖7 不同處理下差異物種的LDA 值分布柱狀圖Fig.7 Histogram of LDA value distribution of different species under different treatments

2.3 根際土壤細菌群落中與煙草青枯病發病相關的菌群分析

2.3.1 根際土壤細菌群落與煙草青枯病發病率和病情指數之間的相關性分析

對相對豐度前50 位的細菌屬與煙草青枯病發病率、病情指數（移栽120 d 后）以及雷爾氏菌屬（Ralstonia）相對豐度進行皮爾遜（Pearson）相關性分析，結果如表3 所示。未確定屬的伯克氏菌科（unidentified_Burkholderiaceae）、未確定屬的芽單胞菌科（unidentified_Gemmatimonadaceae）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、戴氏菌屬（Dyella）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、未確定屬的細菌（unidentified_Bacteria）和Jatrophihabitans屬與煙草青枯病發病顯著正相關，節桿菌屬（Arthrobacter）、未確定屬的瘤胃菌科（unidentified_Ruminococcaceae）、Bryobacter屬、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、未確定屬的毛螺菌科（unidentified_Lachnospiraceae）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）與煙草青枯病發病顯著負相關。雷爾氏菌屬與煙草青枯病發病呈正相關關系，但未達到顯著水平。雷爾氏菌屬與未確定屬的芽單胞菌科、鏈霉菌屬、擬無枝酸菌屬、Jatrophihabitans屬和熱酸菌屬（Acidothermus）顯著正相關。

表3 根際土壤細菌與青枯病發病率和病情指數以及雷爾氏菌屬之間的相關性①Tab.3 Correlations between bacteria in rhizosphere soil and bacterial wilt disease incidence and disease index,or Ralstonia

2.3.2 與煙草青枯病發病顯著相關的菌屬分析

由表4 可知，節桿菌屬和寡養單胞菌屬在MT3 和MT4 處理中的相對豐度顯著高于MT1 和MT2 處理；Bryobacter屬在MT3 處理中的相對豐度顯著高于MT1 和MT2 處理；未確定屬的伯克氏菌科和鏈霉菌屬在MT1 處理中的相對豐度顯著高于MT3 和MT4 處理；未確定屬的芽單胞菌科在MT1 處理中的相對豐度顯著高于MT3 處理；戴氏菌屬在MT1 和MT2 處理中的相對豐度顯著高于MT3 和MT4 處理。雷爾氏菌屬的相對豐度在各處理中差異不顯著，但在MT1 處理中最高。

表4 不同處理中與煙草青枯病發病顯著相關菌屬的相對豐度Tab.4 Relative abundances of genus significantly associated with bacterial wilt disease under different treatments

3 討論

3.1 黃腐酸與微生物菌劑協同對根際土壤細菌群落結構的影響

本研究中發現，黃腐酸與微生物菌劑協同處理有增加根際土壤細菌群落OTUs 總數和特有OTUs 數量的趨勢，同時可顯著提高根際土壤細菌群落觀測物種數、香農指數和辛普森指數等α多樣性指數，這與前人的研究結果一致［22］。α多樣性是對單樣品的多樣性分析，單從α多樣性指數的角度并不能準確說明細菌群落發生了變化，因此，有必要對不同組間樣品的細菌群落構成進行β多樣性比較。本研究中對不同處理進行β多樣性分析發現，未施用黃腐酸處理（MT1 和MT2）和施用黃腐酸處理（MT3 和MT4）的根際土壤細菌物種構成差異較大。對不同分類水平的細菌群落組成分析發現，黃腐酸與微生物菌劑協同處理可顯著提高根際土壤中酸桿菌門的相對豐度，該菌門在土壤物質循環和生態環境構建過程中起到非常重要的作用［23］。黃腐酸與微生物菌劑協同可以促進土壤微生物的生長和繁殖，增加根際土壤細菌數量，提高根際土壤細菌群落多樣性，有效改善根際土壤細菌的生態環境。

3.2 根際土壤細菌群落結構中與煙草青枯病發病相關的菌群

本研究中對與煙草青枯病發病顯著相關的菌屬進行分析發現，節桿菌屬、寡養單胞菌屬和Bryobacter屬的相對豐度在黃腐酸與微生物菌劑協同處理中顯著提高，且與煙草青枯病發病顯著負相關。這些菌群有利于分解土壤有機質、促進碳循環［24］和養分轉化吸收［25］，為植物生長提供足夠的營養，同時還可以降解有機污染物和吸附重金屬［26］，減輕其對根系的損傷，并抑制土傳病原菌對植物生長的危害［27-28］。此外，未確定屬的伯克氏菌科、未確定屬的芽單胞菌科、鏈霉菌屬和戴氏菌屬的相對豐度在黃腐酸與微生物菌劑協同處理中顯著降低，且與煙草青枯病發病顯著正相關。鏈霉菌屬（Streptomyces）被公認為最具價值的一種生防菌，目前已從土壤中篩選出多株可抑制青枯雷爾氏菌的鏈霉菌［29-31］，本研究中鏈霉菌屬的相對豐度在黃腐酸與微生物菌劑協同處理中顯著降低的原因可能是其他致病性鏈霉菌屬物種或腐生鏈霉菌屬物種在根際土壤中聚集較少。田程等［32］研究發現戴氏菌屬與枯萎病發病率呈顯著正相關，與本研究結果一致。沈桂花［33］篩選出了18 個可作為潛在的抑制煙草青枯病的指示細菌類群，其中就包括了節桿菌屬、寡養單胞菌屬、Bryobacter屬和戴氏菌屬等。黃腐酸與微生物菌劑協同通過提高根際土壤中一些有益菌群的相對豐度和降低一些與病害發生呈正相關關系菌群的相對豐度來抑制煙草青枯病的發生。

本研究中還發現，雷爾氏菌屬與煙草青枯病發病正相關，但不顯著，其相對豐度在不同處理間差異也不顯著；雷爾氏菌屬（Ralstonia）在根際土壤中的相對豐度與未確定屬的芽單胞菌科、鏈霉菌屬、擬無枝酸菌屬、Jatrophihabitans屬和熱酸菌屬顯著正相關。表明，黃腐酸與微生物菌劑協同對青枯病原菌的調節能力有限，可能通過調節一些與煙草青枯病發病相關的菌群或者與雷爾氏菌屬相互作用的菌群，從而影響煙草青枯病的發生。植物疾病狀態或健康狀態通常不僅是病原體直接影響的結果，也是微生物群落相互作用間接影響的結果。越來越多的研究發現，植物土傳病害的發生往往是由于土壤微生態失衡失調引起的［34-36］。

4 結論

移栽120 d 后，黃腐酸與微生物菌劑協同可顯著降低煙草青枯病發病率和病情指數，降幅分別為49.32%和64.00%。黃腐酸與微生物菌劑協同可顯著提高根際土壤細菌群落觀測物種數、香農指數和辛普森指數，增幅分別為13.60%、8.37%和0.64%。黃腐酸與微生物菌劑協同根際土壤細菌群落結構發生了明顯變化，可顯著提高根際土壤中節桿菌屬、寡養單胞菌屬和Bryobacter屬的相對豐度，同時顯著降低未確定屬的伯克氏菌科、鏈霉菌屬、未確定屬的芽單胞菌科和戴氏菌屬的相對豐度。根際微生物的數量和種類與植物病害密切相關，調控根際土壤微生物可增強植物抵御病害的能力，合理施用土壤調節劑和微生物菌劑可調控根際土壤微生物多樣性和群落結構，對煙草青枯病起到較好的防治效果。