基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討黃芪治療特發(fā)性肺纖維化的分子機(jī)制

趙夢雅，姜夢筆，楊 欣，張浩宇，劉 楊，黃 高，陳蕾蕾*

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣州 510006

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種以逐漸加重的呼吸困難和肺功能不可逆下降為特征的慢性、進(jìn)行性肺間質(zhì)疾病。此病在發(fā)展過程中受炎癥反應(yīng)、肺損傷、免疫反應(yīng)和纖維生成等要素的綜合影響，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肺泡損傷、成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積等病理表現(xiàn)[1]。我國目前IPF患病人數(shù)呈逐年增加的趨勢，且預(yù)后不良[2]。目前,西醫(yī)治療特發(fā)性肺纖維化多以糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑為主[3]。大量臨床和試驗(yàn)研究表明中醫(yī)藥對IPF的多個(gè)病理環(huán)節(jié)均有明顯的改善作用，可提高患者的生存質(zhì)量，降低死亡率，具有良好的應(yīng)用前景[4]?；跀?shù)據(jù)挖掘分析，中醫(yī)藥在治療此類疾病過程中補(bǔ)益藥的使用頻率高達(dá)55%[5]，其中黃芪的使用頻次為148次[6]，位列第一，以此說明黃芪在特發(fā)性肺纖維化的治療中發(fā)揮了重要作用。

黃芪(Astragali Radix)味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)脾升陽、益肺固表等功效，常用于扶正固本，《神農(nóng)本草經(jīng)》載其“主治癰疽…補(bǔ)虛”，是臨床防治多臟器纖維化的主要中藥之一。黃芪活性成分較多，主要含黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類化合物及三萜類物質(zhì)。目前，黃芪的化學(xué)成分及活性成分受到廣泛關(guān)注，隨著各方對黃芪藥理作用研究的不斷深入，黃芪甲苷、黃芪多糖、黃芪總皂苷[7]及黃芪注射液[8]，已在IPF的治療中取得療效。因此本研究以黃芪化學(xué)成分為切入點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，探討黃芪治療IPF的關(guān)鍵活性成分及調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，為開發(fā)及臨床用黃芪提供理論依據(jù)。具體流程見圖1。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本次研究過程中所使用和涉及的數(shù)據(jù)庫及軟件見表1。軟件運(yùn)行于Windows操作系統(tǒng)平臺。處理器為Inter(R) Core(TM) i5-10400 CPU@2.90GHz，64位操作系統(tǒng)。使用的相關(guān)軟件已授權(quán)或開源軟件。

1.2 篩選黃芪化學(xué)成分及靶點(diǎn)

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)以“黃芪”為關(guān)鍵詞進(jìn)行化學(xué)成分檢索?；赟wiss Target Prediction預(yù)測黃芪化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)黃芪所有化學(xué)成分的SMILES進(jìn)行預(yù)測，在線打開Swiss Target Prediction，選擇“old.swisstargetprediction.ch”依次上傳黃芪活性成分的SMILES結(jié)構(gòu)式，選擇“Homo sapiens”，其他參數(shù)默認(rèn)，點(diǎn)擊“Submit”即可預(yù)測靶點(diǎn)。

1.3 特發(fā)性肺纖維化疾病靶點(diǎn)篩選

基于人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards和比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫CTD兩個(gè)平臺，輸入關(guān)鍵詞“idiopathic pulmonary fibrosis”，收集與特發(fā)性肺纖維化相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，使用FunRich 3.1.3軟件將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所得的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集構(gòu)建疾病靶點(diǎn)庫，再與預(yù)測所得的活性成分靶點(diǎn)取交集，最終篩選出黃芪治療特發(fā)性肺纖維化的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG通路分析

利用R語言中的clusterProfiler包進(jìn)行GO和KEGG分析，對潛在作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過程(biological process，BP)，細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個(gè)方面分別進(jìn)行富集分析，首先在R軟件安裝Biocondoctor軟件包“org.Hs.eg.db”并運(yùn)行，將黃芪治療特發(fā)性肺纖維化的關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)換成entrez ID。然后在R軟件安裝clusterProfiler包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrez ID，設(shè)定種為人源，選擇P(P-value)<0.05且校正的P(P.adjust)<0.05為閾值進(jìn)行關(guān)鍵靶基因GO和KEGG的富集分析，并將結(jié)果以氣泡圖的形式輸出。

1.5 蛋白相互作用(PPI)分析

STRING數(shù)據(jù)庫是一種檢索蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，收集了包括實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的以及通過生物信息學(xué)方法預(yù)測得到在內(nèi)的大量PPI數(shù)據(jù)。打開STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”，將黃芪與特發(fā)性肺纖維化的共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入，將Organism設(shè)置為“Homo”進(jìn)行篩選，選擇中等置信度為0.400，獲取PPI關(guān)系，建立PPI網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用R軟件包，繪制條形圖展示關(guān)鍵靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中相互作用的頻次(degree)。

1.6 黃芪活性成分和作用靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB中獲取前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2，PDB-ID：3W15)，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA，PDB-ID：3BDY)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，PDB-ID：1GKC)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3，PDB-ID：4E68)，表皮生長因子受體(EGFR，PDB-ID：1M17)，PDB格式保存。后將其導(dǎo)入SYBYL 2.1.1軟件中進(jìn)行預(yù)處理，包括提取配體小分子、去除水分子、加氫等。將從PubChem數(shù)據(jù)庫下載的活性化合物3D結(jié)構(gòu)的sdf文件進(jìn)行能量優(yōu)化，利用SYBYL 2.1.1中的Surflex-Dock模塊將對應(yīng)的化合物與蛋白進(jìn)行分子對接，利用打分函數(shù)進(jìn)行評價(jià)。采用藥物分子設(shè)計(jì)模擬SYBYL 2.1.1軟件的Surflex-Dock和模塊完成分子對接研究。初始篩選采用標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行對接，修飾后的小分子與靶標(biāo)蛋白進(jìn)行半柔性對接，對接過程中閾值參數(shù)0.5，其他參數(shù)為系統(tǒng)缺省值。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200 ± 20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2019-0008，于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由飲食飲水。

1.7.2 藥物、試劑與儀器

1.7.2.1 藥物

黃芪飲片(批號2008002，安國市彤康藥業(yè)有限公司)；葉酸(批號F809516-5 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，上海麥克林生化科技有限公司)；博來霉素(國藥準(zhǔn)字H20055883，規(guī)格1.5萬單位/支，海正輝瑞制藥公司)。

1.7.2.2 試劑

蘇木精-伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1120)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1340)；大鼠白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒(批號MM-0088R1，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；大鼠基質(zhì)蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)ELISA試劑盒(批號MM-0055R1，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)

1.7.2.3 儀器

組織包埋機(jī)(EG1150 H，德國Leica)；石蠟切片機(jī)(KD3368，浙江金華科迪有限公司)；光學(xué)顯微鏡(DP73，日本OLYMPUS株式會社)；高速冷凍臺式離心機(jī)(x-30R BECKMAN COULTER)；生化培養(yǎng)箱(SPX-150A，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(1510-01061C Thermo Fisher)。

1.7.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.3.1 模型制備及分組

SPF級SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、葉酸治療組及黃芪治療組，每組10只，除空白對照組外其余大鼠按體質(zhì)量用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，觀察呼吸及反應(yīng)，穩(wěn)定后將大鼠仰臥30°固定于手術(shù)臺上，酒精消毒頸部皮膚，剪刀縱向切開頸部皮膚1 cm左右，手術(shù)鑷逐層鈍性分離頸部組織，直至氣管暴露。模型對照組及藥物處理組大鼠按體質(zhì)量氣管注射博來霉素(bleomycin，BLM)，濃度為1 mg/mL(生理鹽水溶解)，給藥劑量為5 mg/kg，隨即將大鼠頭部抬起直至大鼠完全直立，使博來霉素注射液均勻分布于兩肺，縫合皮膚，放入鼠籠保溫待其蘇醒，醒后正常飲水進(jìn)食，觀察大鼠一般狀況。

1.7.3.2 給藥及標(biāo)本采集

術(shù)后連續(xù)飼養(yǎng)3天，而后開始灌胃給藥。根據(jù)《中國藥典》2020版，稱取黃芪30 g，8倍水量浸泡30 min，先武火后文火煎煮3次，合并濃縮濾液。給藥劑量參考徐叔云主編《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，按體表面積和人與動物臨床劑量倍數(shù)進(jìn)行換算，得出大鼠的給藥等效劑量黃芪3.15 g/kg，葉酸0.04 mg/kg。每天灌胃1次，持續(xù)28天，末次給藥1 h后將各組大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹主動脈采血處死，摘取左肺組織，PBS溶液清洗殘血，置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存，用于組織病理學(xué)檢測。采血管放入離心機(jī)，3 000 rpm離心10 min得到血清，-80 ℃冰箱凍存。

1.7.3.3 HE染色和Masson染色

將4 ℃冰箱固定24 h后的肺組織取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋操作，即自來水沖洗過夜、由低到高濃度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋，4 ℃冰箱保存過夜，取出包埋組織以5 μm厚度切片，具體染色步驟按照試劑盒說明書內(nèi)容進(jìn)行操作，染色結(jié)束后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色的炎癥反應(yīng)情況及Masson染色的膠原增殖情況。

1.7.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中IL-17、MMP-9蛋白的表達(dá)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清中IL-17及MMP-9蛋白表達(dá)水平。使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中各細(xì)胞因子的含量，按照試劑盒說明書在室溫下規(guī)范操作即可。首先稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行加樣、37 ℃溫育30 min、配制洗滌液、洗滌5次、加酶、再次37 ℃溫育30 min并洗滌5次、加顯色劑顯色、加終止劑終止反應(yīng)，最后使用450 nm波長的酶標(biāo)儀迅速測定各孔的吸光度(OD值)，將測定結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫軸，濃度為縱軸求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將測得的各組樣品本OD值代入方程式，得出樣品稀釋后的濃度，將其乘以稀釋倍數(shù)則可得到樣品的實(shí)際濃度。

1.7.3.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪抗特發(fā)性肺纖維化靶標(biāo)分析

中藥黃芪基于TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出87個(gè)化學(xué)成分，87個(gè)化學(xué)成分獲得1 305個(gè)靶基因?；贕eneCards獲得713個(gè)IPF的相關(guān)基因，基于CTD篩選獲得1 981個(gè)IPF的相關(guān)基因，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫共交集272個(gè)靶點(diǎn)(圖2A)。272個(gè)特發(fā)性肺纖維化的相關(guān)基因與黃芪化學(xué)成分靶基因進(jìn)行交集，共篩選出25個(gè)黃芪抗特發(fā)性肺纖維化的靶基因(圖2B和表2)?；贑ytoscape 3.6.1建立黃芪化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型(見圖2C)。

圖2 黃芪化學(xué)成分-靶點(diǎn)-特發(fā)性肺纖維化Fig.2 Chemical composition of Astragali Radix-target-idiopathic pulmonary fibrosis

表2 黃芪治療特發(fā)性肺纖維化的靶點(diǎn)Table 2 The therapeutic target of Astragali Radix for idiopathic pulmonary fibrosis

2.2 GO和KEGG通路富集分析

25個(gè)差異基因的GO富集分析主要是使用R中clusterProfiler包完成，輸出25個(gè)差異基因的GO前10項(xiàng)(見圖3A～C)，其中橫坐標(biāo)GeneRatio表示輸入的基因占整體基因的百分之比(%)。圓圈的大小代表基因的數(shù)量，圓圈的顏色代表校正的P值(P.adjust)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)25個(gè)靶點(diǎn)參與的生物過程中主要富集于活性氧化代謝，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等(P-value < 0.05)；基因主要定位于囊泡腔、內(nèi)吞囊泡腔(P-value < 0.05)；分子功能主要為內(nèi)肽酶、絲氨酸型肽酶和金屬肽酶活性等(P-value < 0.05)，如表3所示。

25個(gè)靶點(diǎn)涉及29條信號通路(P-value<0.05)，基于R輸出前10項(xiàng)(圖3D)，主要涉及IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。

圖3 關(guān)鍵靶基因的GO與KEGG通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of GO and KEGG pathways of key target genes

2.3 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

25個(gè)靶點(diǎn)使用STRING結(jié)合Cytoscape 3.6.1進(jìn)行PPI分析(見圖4A)，25個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切。利用R語言根據(jù)節(jié)點(diǎn)的degree繪制蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖，如圖4B所示。Degree>15的節(jié)點(diǎn)包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和表皮生長因子受體(EGFR)。我們將進(jìn)行一步采用分子對接進(jìn)行驗(yàn)證分析，關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)見表4。

表4 關(guān)鍵靶標(biāo)的生物學(xué)效應(yīng)Table 4 Biological effects of key targets

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用Fig.4 Protein-protein interaction

2.4 分子對接

基于SYBYL 2.1.1分子對接驗(yàn)證黃芪87個(gè)化學(xué)成分與5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合情況，對接結(jié)果以打分函數(shù)T_score≥5為閾值，T_score≥5表示活性成分與靶標(biāo)蛋白有較好的結(jié)合。T_score>7說明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。分子對接結(jié)果見表5。黃芪6個(gè)化學(xué)成分能同時(shí)與5個(gè)靶點(diǎn)(PTGS2、VEGFA、MMP-9、STAT3、EGFR)有較好的結(jié)合(T_score≥5，圖5A)；黃芪6個(gè)化學(xué)成分能同時(shí)與4個(gè)靶點(diǎn)(PTGS2、VEGFA、MMP9、STAT3)有較好的結(jié)合(T_score≥5，圖5B)；黃芪12個(gè)化學(xué)成分能同時(shí)與3個(gè)靶點(diǎn)(PTGS2、VEGFA、MMP-9)有較好的結(jié)合(T_score≥5，圖5C)；黃芪19個(gè)化學(xué)成分能同時(shí)與2個(gè)靶點(diǎn)(PTGS2、VEGFA)有較好的結(jié)合(T_score≥5，圖5D)。同時(shí)黃芪中的異鼠李素、黃素、葉酸、落葉松樹脂醇、5′羥基異氟尿嘧啶-2′，5′-di-O-葡萄糖、異黃酮可能是黃芪治療特發(fā)性肺纖維化的關(guān)鍵成分，我們將進(jìn)一步深入研究。

表5 黃芪活性成分與靶標(biāo)蛋白分子對接得分Table 5 The docking score of Astragali Radix active component and target protein

續(xù)表5(Continued Tab.5)

圖5 關(guān)鍵靶基因與黃芪活性成分對接Fig.5 Docking of key target genes with the active component of Astragali Radix

2.5 黃芪及葉酸對IPF大鼠肺組織炎癥程度和膠原增殖的影響

HE染色結(jié)果詳見圖6?？瞻讓φ战M大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔正常，支氣管周圍無充血、滲出等病理表現(xiàn)，也未見明顯的炎癥反應(yīng)。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)塌陷粘連、大量融合致數(shù)量減少，肺泡壁明顯增厚，毛細(xì)血管充血，被大量炎性細(xì)胞浸潤，肺纖維結(jié)節(jié)大量出現(xiàn)，形成肺纖維化瘢痕，出現(xiàn)大片肺實(shí)變區(qū)域。同模型對照組比較，葉酸治療后有所好轉(zhuǎn)，但肺泡結(jié)構(gòu)仍然雜亂，組織周圍仍有較多炎性細(xì)胞浸潤，組織被破壞程度介于空白組與模型組之間；黃芪治療后改善作用明顯，雖有輕微炎癥反應(yīng)，但肺泡結(jié)構(gòu)較清晰。

圖6 黃芪和葉酸對IPF大鼠肺組織內(nèi)炎癥程度的影響(HE染色，×50)Fig.6 Effects of Astragali Radix and folic acid on the degree of inflammation in the lung tissue of IPF rats (HE staining,×50)注：A：空白對照組；B：模型對照組；C：葉酸治療組；D：黃芪治療組，下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Folic acid treatment group;D:Astragali Radix treatment group,the same below.

Masson染色結(jié)果詳見圖7?？瞻讓φ战M大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，僅有少量的膠原纖維存在。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)塌陷皺縮，分布雜亂，膠原纖維增殖明顯，大面積染藍(lán)。同模型對照組比較，2個(gè)治療組肺組織結(jié)構(gòu)紋理尚為清晰，膠原染色面積有所減少，具有改善作用。

圖7 黃芪和葉酸對IPF大鼠肺組織內(nèi)膠原增殖程度的影響(Masson染色，×50)Fig.7 Effects of Astragali Radix and folic acid on collagen proliferation in lung tissue of IPF rats(Masson staining,×50)

2.6 ELISA檢測各組大鼠血清中IL-17及MMP-9的表達(dá)結(jié)果

各組大鼠血清中IL-17、MMP-9含量詳見表6。

表6 各組大鼠血清IL-17、MMP-9含量Table 6 Serum IL-17 and MMP-9 contents of rats in each group = 10)

同空白對照組相比，模型對照組大鼠血清IL-17、MMP-9含量均明顯增高(P< 0.01)。同模型對照組相比，各組大鼠血清IL-17、MMP-9含量均明顯降低(P< 0.01)。2個(gè)藥物治療組之間相比，黃芪治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量略低于葉酸治療組。

3 討論與結(jié)論

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明，呈慢性進(jìn)行性加重且難以逆轉(zhuǎn)的最常見的肺系疾病[9]，是炎癥反應(yīng)、肺損傷、免疫反應(yīng)和纖維生成4個(gè)要素的綜合結(jié)果。IPF影響全球約300萬人，多發(fā)于中老年人，以逐漸加重的呼吸困難和肺功能不可逆下降為特征，預(yù)后不良。IPF生存率低，發(fā)病率高，被稱為“類腫瘤疾病”，一經(jīng)確診，患者的生存率會逐年下降，3年的患病時(shí)長尚可保證50%的生存率，一旦達(dá)到5年，其生存率會下降至僅剩20%[10]，是嚴(yán)重危害公眾健康的重大疾病。

黃芪(Astragali Radix)乃補(bǔ)氣之長者，主入肺、脾二經(jīng)，因其廣泛的作用范圍和明確的功效而成為中醫(yī)臨床治療肺纖維化的最常用中藥之一。其化學(xué)成分諸多，藥理研究表明黃芪能夠增強(qiáng)免疫功能，具有抗炎、抗菌、抗病毒與抗缺氧等作用，可降低肺中膠原含量[11]，為臨床防治多臟器纖維化的主要中藥之一。目前已發(fā)表的文獻(xiàn)中多以黃芪的主要成分黃芪甲苷、黃芪總黃酮等作為主要研究對象，本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)黃芪治療IPF的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示異鼠李素、葉酸等6種化合物與IPF的多個(gè)靶點(diǎn)連接度較高，分子對接結(jié)果提示這些成分可能在黃芪治療IPF的過程中發(fā)揮作用。Zheng等[12]研究證實(shí)異鼠李素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化保護(hù)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化；Kawami等[13]研究發(fā)現(xiàn)葉酸可能有效抑制mtx誘導(dǎo)的肺損傷；Yao等[14]研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的葉酸受體β表達(dá)在IPF中起著致病性作用，針對表達(dá)葉酸受體β的巨噬細(xì)胞的靶向治療也許是治療IPF的有效方法。

GO和KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，黃芪治療IPF靶點(diǎn)涉及通路主要與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)，結(jié)合分析結(jié)果及文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)IL-17信號通路、EGFR信號通路及HIF-1信號通路與IPF的關(guān)聯(lián)度較高。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-17可作為肺纖維化輔助診斷指標(biāo)，預(yù)測藥物療效，評估治療效果；Pan等[16]研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的IL-17表達(dá)含量明顯升高，炎癥反應(yīng)持續(xù)；Ma等[17]研究發(fā)現(xiàn)CBPP的PEI作為先導(dǎo)化合物，可以通過作用于EGFR和MLC2信號通路，改善肺功能，減輕肺纖維化；Wang等[18]通過研究證實(shí)百草枯能夠通過激活HIF-1α信號通路來啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序，進(jìn)而誘導(dǎo)肺纖維化的產(chǎn)生。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTGS2、VEGFA、MMP-9、STAT3及EGFR為關(guān)鍵靶點(diǎn)，分子對接結(jié)果說明黃芪化學(xué)成分能與其有較好的結(jié)合，目前，已有研究表明這些靶點(diǎn)在IPF中發(fā)揮重要作用。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)益氣溫陽活血利水法能夠改善腎臟損傷，減少纖維化，其機(jī)制可能為調(diào)控PTGS2/NOX1信號通路進(jìn)而降低ROS水平減少細(xì)胞鐵死亡；BLM誘導(dǎo)大鼠的實(shí)驗(yàn)表明，抑制VEGFR可能會減少纖維化，而VEGF的過表達(dá)會加重肺纖維化的進(jìn)程[20-22]；Luan等[23]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過降低VEGF、VEGFR2基因表達(dá)水平來發(fā)揮抗肺纖維化的作用；MMP-9是一種IV型膠原酶，可以降解分布于肺基底膜和間質(zhì)的膠原ECM等成分，導(dǎo)致肺損傷并啟動肺纖維的發(fā)生，Ren等[24]研究發(fā)現(xiàn)通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方可調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP1失衡，減少FN、Col Ⅳ的過度沉積，進(jìn)而改善大鼠肺功能，抑制大鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展；Wu等[25]研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的STAT3基因，STAT3活性表達(dá)增加而減少成纖維細(xì)胞的凋亡，更易被BLM誘導(dǎo)發(fā)生肺纖維化，提示STAT3蛋白可能促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)生。以表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)為代表的EGF生長因子家族及其受體EGFR均在肺纖維化的病程中起著重要作用，Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)EGFR在博萊霉素染毒大鼠肺組織損傷的不同組別表達(dá)水平具有明顯差異，IPF組患者肺組織中的EGFR表達(dá)水平明顯高于對照組患者，以此推測IPF的發(fā)生可能與EGFR高表達(dá)有關(guān)。

HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，IPF大鼠肺內(nèi)積有大量炎癥細(xì)胞，膠原增殖程度明顯增加，肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，膠原組織替代了正常的肺泡結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肺的呼吸功能受損，經(jīng)葉酸和黃芪治療后病理情況有所改善，黃芪的治療效果更為明顯。實(shí)驗(yàn)大鼠血清ELISA結(jié)果顯示，模型對照組及2個(gè)藥物治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量與空白對照組相比均有明顯增高，其中模型對照組含量最高。2個(gè)藥物治療組干預(yù)效果顯示，黃芪組大鼠血清IL-17、MMP-9含量明顯低于葉酸組。從趨勢上來看，藥物治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量同模型對照組比均有所降低，說明其能夠通過抑制IPF大鼠血清中IL-17、MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而起到抗IPF的作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對黃芪治療IPF的成分-靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪活性成分對于IPF具有治療作用，提示篩選具有合理性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步明確黃芪防治IPF的關(guān)鍵靶點(diǎn)及活性成分，黃芪的治療效果優(yōu)于其活性成分葉酸的治療效果，側(cè)面體現(xiàn)黃芪是通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用治療IPF的特點(diǎn)，但由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，詳細(xì)的作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。