TLC-NIRS聯(lián)用技術快速檢測保健品中非法添加性保健類化學藥物研究

張立軍，賈建忠，張新玥，張轉(zhuǎn)平*，譚華森，徐桂新，李小安，劉家佳

1陜西省安康市食品藥品檢驗檢測中心，安康 725000；2北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；3陜西省食品藥品研究院，西安 710061

隨著大眾保健意識的日益增強，人們對保健品需求與日俱增，特別是標注中藥類的保健品。保健品是保健食品的通俗說法，在國外稱為膳食補充劑(dietary supplements)不屬于藥品范疇，具有調(diào)節(jié)人體機能，用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的[1]。面對高額利潤誘惑，不法商販在保健品中超劑量添加價格低廉、副作用明顯的化學原料藥增強產(chǎn)品功效，很大程度上擾亂了我國保健品市場，給國民身體健康造成了嚴重威脅，如2009年發(fā)生在新疆地區(qū)輔助降糖保健品“糖脂寧膠囊”中超劑量添加違禁化藥格列本脲致多人死亡、2014發(fā)生在山西省“纖纖減肥膠囊”因添加違禁化藥西布曲明及西地那非致使多人出現(xiàn)不良反應甚至喪命、近些年來在保健品抽檢評價中發(fā)現(xiàn)不法廠家在性保健品及中藥保健制劑中添加超劑量的西地那非欺騙消費者，嚴重危害了消費者的健康[2,3]；類似在性保健、降糖及減肥類保健品中超劑量添加違禁化藥那非類、雙胍類、呋塞米及酚酞等現(xiàn)象層出不窮，添加隱蔽性越來越高[4,5]；在國外此類現(xiàn)象也時常發(fā)生[6]。這些影響面廣、危害大的違法行為值得藥監(jiān)部門深思，開發(fā)市場快速抽檢檢測方法顯得尤為重要。

目前用于中成藥和保健品中非法添加化藥的檢測方法主要包括薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)[7]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)[10]、離子遷移譜(ion mobility spectrometry，IMS)及拉曼光譜(raman spectrometry，RS)[11]等。在已報道的各種檢測方法中，LC-MS、GC-MS及IMS等技術研究相對較多，但由于儀器價格昂貴、操作復雜，不易推廣，在經(jīng)濟發(fā)展相對落后的城市山區(qū)很難普及。TLC 為傳統(tǒng)藥品四大鑒別之一，具有快速、簡便、分離效果好的特點，廣泛應用于藥品定性定量鑒別中，但缺點是必須要有相應對照品或?qū)φ账幉腫12,13]。近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)是近幾年發(fā)展起來的，是以采集被檢測物質(zhì)在近紅外譜區(qū)C-H、O-H、S-H、N-H、C=C及C=O等基團振動、轉(zhuǎn)動吸收信息用于物質(zhì)定性和定量分析，廣泛應用于農(nóng)業(yè)、石油、化工、煙草及食品中，目前已被逐步應用于制藥與藥監(jiān)行業(yè)，在藥品快速定性定量檢測分析方面具有很大的發(fā)展?jié)摿14,15]。因此，本文預采用現(xiàn)有普及強的儀器與檢驗方法創(chuàng)建TLC-NIRS聯(lián)用技術，以性保健品為例，建立一種通用性強的非法添加違禁性保健類化學藥物定性定量檢測模型，可以高效、快速、簡便的用于市場保健品中添加違禁化學藥物篩查與檢測，降低檢測成本。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

傅里葉變換Tensor 37 NIR光譜儀(德國BRUKER公司)，OPUS 5.0分析軟件； LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，LC Solution色譜工作站；BS224S電子分析天平(德國Sartorius公司)；硅膠GF254薄層板(青島海洋生物化工有限公司)。

1.2 試藥

西地那非(510068-201401，99.9%)、那紅地那非(520039-201902，96.5%)均購于中國食品藥品研究院，結(jié)構見圖1。甲醇為色譜純，水為超純水，三氯甲烷、磷酸及氨水均為分析純。保健樣品為市場抽檢樣品。

圖1 性保健類化學藥物的結(jié)構Fig.1 Structures of sex-enhancing chemical drugs

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液與樣品溶液制備

對照品溶液制備：分別取西地那非、那紅地那非約25 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解配制成各約5 mg/mL的混合對照品儲備溶液；再分別取西地那非、那紅地那非約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解配制成各約1 mg/mL的單個指認對照品溶液。

樣品溶液制備：分別取本品一次服用量，置5 mL量瓶中，加甲醇超聲30 min(100 W，56 kHz)，冷卻，加甲醇定容至刻度，過濾取續(xù)濾液。含量測定時，分別精密量取各樣品溶液1 mL用流動相溶解定容至25 mL，用0.45 μm濾膜濾過。由于陽性樣品(檢出添加違禁化學藥物的保健品)中檢出的各組成分質(zhì)量濃度差異較大，可適當增加取樣量或者適當稀釋樣液，使其最終質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)。

陽性樣品溶液制備：由于那紅地那非未抽到陽性樣品，故取空白樣品(黃精巴戟天膠囊，洛陽康體生物，檢測結(jié)果為陰性)一次服用劑量，加入適當稀釋的那紅地那非對照品溶液，按樣品溶液項下制備方法制備陽性樣品溶液，使陽性樣品溶液中那紅地那非的質(zhì)量濃度分別約為5、7.5、10 mg/mL，每個質(zhì)量濃度分別平行制備4、3、3份。

2.2 色譜條件與光譜條件

2.2.1 HPLC色譜條件

采用Phenomenex ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；45%甲醇(A)-55%的0.3%磷酸水溶液(B)為流動相洗脫30 min；流速1 mL/min，檢測波長290 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 TLC色譜條件

采用硅膠GF254薄層色譜板，以三氯甲烷-甲醇-氨水(10∶1∶0.1)為展開劑展開、揮干，干燥器干燥1 h后，254 nm紫外燈下檢視標記(見圖2)。

圖2 性保健品TLC色譜圖Fig.2 The TLC of sex-enhancing products注：1.那紅地那非；2.西地那非；3～12.樣品溶液。Note:1.Noracetildenafil;2.Sildenafil;3-12.Sample solution.

2.2.3 NIRS采集條件

采用BRUKER NIR固體光纖探頭測量，波數(shù)范圍12 000～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64次，分辨率為16 cm-1，溫度10～30 ℃，濕度35%±5%，以空白硅膠GF254薄層板作為參比，扣除背景采集光譜圖，每個化學成分斑點平行測定5次，保存NIRS信息。

2.3 HPLC含量測定方法建立

2.3.1 線性關系考察

精密吸取混合對照品儲備溶液(西地那非5.25 mg/mL；那紅地那非5.15 mg/mL)2.0 mL加甲醇定容至10 mL，再分別精吸取0.25、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用流動相溶解分別定容至5 mL，搖勻。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，以各成分峰面積為縱坐標(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)計算回歸線方程：西地那非為Y=3×106X-36 606，r=0.998 9，線性范圍0.052 5～1.05 μg；那紅地那非為Y=1×106X-3 184.4，r=0.999 9，線性范圍0.051 5～1.03 μg，結(jié)果表明上述對照品在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性、重復性及回收率試驗

分別取“2.3.1”項下混合對照品溶液以及取空白樣品(黃精巴戟天膠囊，洛陽康體生物，檢測結(jié)果為陰性)按“2.1”項下方法平行制備6份含西地那非和那紅地那非的樣品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，精密度取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次；穩(wěn)定性取其中一份制備樣品溶液分別于0、3、6、9、12、24 h進樣；重復性與回收率取6份平行制備樣品溶液，每份進樣一次，分別測定西地那非、那紅地那非的峰面積，計算回收率及其RSD值。結(jié)果西地那非和那紅地那非的平均回收率分別為100.16%、100.49%；RSD值均小于3%(n=6)，表明儀器的精密度良好、樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定、該法具有較好的回收率及良好重復性。

2.3.3 含量測定

精密吸取各樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，每批測定3次，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，在10批性保健樣品中，9批檢出添加了違禁化學藥物西地那非，添加劑量差異很大，檢出率90%，結(jié)果見表1和見圖3。

表1 10種性保健品中非法添加化學藥物的檢測結(jié)果(n=3)Table 1 Determination results of substances illegally added in 10 sex-enhancing products (n=3)

圖3 10種性保健品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of 10 sex-enhancing products注：A.混合對照品；B.空白(S0)與樣品(S1～S10)。Note:A.Mixed reference substances;B.Blank(S0)and samples (S1-S10).

2.4 性保健類化學藥物TLC-NIRS定性模型建立

2.4.1 圖譜信息采集

按“2.2.3”項下條件分別采集TLC薄層板上展開后經(jīng)指認的對照品斑點NIRS。混合對照品溶液點樣體積分別為1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μL，樣品溶液點樣體積分別為2、5、10 μL，混合對照品和樣品不同點樣體積下的每個對照品斑點分別采集5次，NIRS疊加圖見圖4。實驗中選取混合對照品不同點樣體積下的光譜圖作為校正集，樣品不同點樣體積下光譜圖作為驗證集，保證驗證集圖譜信息處于校正集圖譜信息范圍之內(nèi)。

圖4 化學藥物的NIR原始光譜疊加圖Fig.4 Original NIR spectra of chemical drugs注：A.西地那非；B.那紅地那非；C.空白硅膠。Note:A.Sildenafil;B.Noracetildenafil;C.Blank silica gel.

2.4.2 模型建立

研究采用NIR光譜儀自帶的OPUS軟件對每個對照品光譜進行預處理。由于化學成分光譜信息受到外界噪聲、基線漂移、光散射、背景信號及溫濕度等影響，因此研究采用多散射校正(multiplication signal correction，MSC)、矢量歸一化法(vector normalization，VN)、最小最大歸一化(minimum maximum normalization，MMN)、消除常數(shù)偏移量(constant offset elimination，COE)、一階導數(shù)(first derivative，F(xiàn)D)、二階導數(shù)(second derivative，SD)及平滑點數(shù)(smoothing points，SP，平滑點數(shù)5、7、9、13、17、21、25)的過濾組合法處理光譜中存在的無用信息，提高模型判別準確度，以校正集樣品判錯數(shù)為指標(見表2)。

表2 光譜預處理結(jié)果Table 2 Results of spectral pretreatment

在原始光譜預處理基礎上，使用光標交互式選擇差別較大的譜區(qū)范圍；采用標準算法-歐氏距離(standard，STD)與因子化法-因子數(shù)目(factorization，F(xiàn)C)計算分析方法；設置閾值(0.25)與置信水平(95%～99.999 9%)，結(jié)合OPUS軟件優(yōu)化及交互式手動優(yōu)化，綜合考慮選擇最佳建模譜區(qū)及計算方法，以100%識別結(jié)果為考察指標，最終保證所有樣品均被唯一被識別“uniquely identified”(見表3)。

表3 優(yōu)選模型數(shù)據(jù)Table 3 Optimization model of data

2.4.3 模型驗證

為檢測定性模型的預測性能，對建立的定性模型進行內(nèi)部驗證和外部驗證，內(nèi)部驗證采用校正光譜對所建模型進行評價驗證。外部驗證采用建模外的10批樣品進行外部驗證。驗證結(jié)果顯示，西地那非與那紅地那非的內(nèi)部驗證及10批樣品外部驗證準確度均為100%，表明所建立的TLC-NIRS定性模型可以用于性保健品中添加上述違禁化學藥物的快速檢查。

2.5 性保健類化學藥物TLC-NIRS定量模型建立

2.5.1 精密度、穩(wěn)定性及重復性試驗

取“2.1”項下混合對照品溶液，平行點樣6份，點樣體積5 μL，按“2.2.2”項下色譜條件展開、揮干。干燥后，按“2.2.3”項下條件分別采集TLC上西地那非及那紅地那非對照品斑點NIRS，精密度試驗分別連續(xù)采集6次；重復性試驗每個斑點分別采集1次；穩(wěn)定性試驗每隔2 h分別采集一次，得各自NIRS，對所得譜圖進行相似度比較。結(jié)果其相似度值均大于95.00%，說明儀器精密性的良好、對照品斑點在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性、該法具有良好的重復性。

2.5.2 最低識別濃度

取“2.1”項下混合對照品溶液，進行系列稀釋。點樣體積5 μL，按“2.2.2”項下色譜條件展開、揮干。干燥后，按“2.2.3”項下條件分別采集TLC上各個對照品斑點光譜圖，記錄其NIRS圖譜。采用主成分分析法(principal components analysis，PCA)分別對每個對照品光譜進行聚類分析，統(tǒng)計對照品不同濃度間差異情況，按馬氏距離大于3.0的濃度判定為最低識別濃度。同時對每個對照品最低識別濃度NIRS進行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均低于50.00%。分別得到西地那非、那紅地那非對照品的最低識別濃度為0.525、0.515 μg/μL。不同點樣濃度對TLC-NIRS的影響(見圖5)。

圖5 西地那非與那紅地那非濃度對其TLC-NIRS的影響Fig.5 Influence of different concentration of sildenafil and noracetildenafil on the TLC-NIRS注：A.Sildenafil：a.0.525 μg/μL、b.1.050 μg/μL、c.2.625 μg/μL、d.5.250 μg/μL、e.10.50 μg/μL、f.26.25 μg/μL；B.Noracetildenafil：a.0.515 μg/μL、b.1.030 μg/μL、c.2.575 μg/μL、d.5.150 μg/μL、e.25.75 μg/μL。

2.5.3 NIRS的采集與預處理

NIRS的采集同“2.4”定性模型項下，采用OPUS軟件對上述NIRS進行預處理、光譜波段區(qū)間的選擇與優(yōu)化、主因子數(shù)選擇。通過偏最小二乘法(partial least square，PLS)和交叉檢驗法分別建立每個對照品的定量模型，以決定系數(shù)(correlation coefficient，R2)、驗證均方差(root mean square error of cross-validation，RMSECV)和相對分析誤差(RPD)為考察指標對建模效果進行評價。一般認為R2越接近1，RMSECV 越小，模型的準確度和預測效果越好，當RPD>2.5，則認為所建模型可以滿足分析要求[16,17]。西地那非、那紅地那非光譜預處理方法及光譜最佳譜區(qū)(見表4)。

表4 不同預處理方法與光譜區(qū)段對模型的影響Table 4 Effects of different spectra pretreatments and spectral section on the models

2.5.4 定量模型建立

采用上述最佳光譜預處理方法、譜區(qū)范圍及主因子數(shù)建立性保健類化學藥物定量分析模型，其中西地那非、那紅地那非預測的R2分別為0.984、0.982，均大于0.85；其RMSECV分別為0.085、0.098，均為各自模型隨變量變化的最小值，推測上述預測模型擁有較好的預測能力。為了檢驗所建模型的預測效果，對驗證集樣品相應化學成分進行了預測，結(jié)果顯示預測值與實測值之間有良好的線性關系，結(jié)果見圖6。說明可以通過TLC-NIRS模型對保健品中添加違禁性化學藥物進行快速定量分析，各模型的預測范圍、R2、RMSECV及RMSEP指標(見表5)。

圖6 保健品中化學藥物的TLC-NIRS定量檢測模型Fig.6 TLC-NIRS quantitative model of chemical drugs in health products

表5 保健品中化學藥物含量的TLC-NIRS檢測模型Table 5 TLC-NIRS quantitative model of chemical drugs in health products

2.5.5 模型驗證與應用

利用上述模型分別對10批性保健樣品和10批自制的那紅地那非樣品進行檢驗。TLC-NIRS模型預測結(jié)果與HPLC含量測定結(jié)果相一致，西地那非與那紅地那非的預測值和實測值之間的R2分別為0.982、0.996(見圖6)；經(jīng)計算9批性保健樣品預測值的平均相對偏差為1.86%，10批自制那紅地那非樣品預測值的平均相對偏差為1.96%，表明模型預測結(jié)果準確可靠(見表6)。

表6 10批性保健品的TLC-NIRS模型預測值Table 6 TLC-NIRS predicted values of 10 sex-enhancing products

續(xù)表6(Continued Tab.6)

3 結(jié)論

本研究首次創(chuàng)建TLC-NIRS聯(lián)用技術，是因為TLC為經(jīng)典的傳統(tǒng)鑒別分析法，具有操作簡便、普及性強等優(yōu)點[12]。TLC對樣品處理自由空間大，針對可能添加的違禁化學藥物可選擇不同提取溶劑，很好的避免不同廠家產(chǎn)品因輔料不同對NIRS的影響；TLC可選材料較多，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，展開劑可選不同極性試劑，以適用不同種類化學成分分離分析。同時，還可以采用不同的展開系統(tǒng)進行雙向展開，具有較好的分離效果[12,13]，可以很好提高NIRS采集化學物藥物信息的準確率。NIRS為近些年發(fā)展起來快速分析儀器，具有操作簡便、分析速度快、無化學污染等特點[14]。本文結(jié)合了各自優(yōu)點首次創(chuàng)建了TLC-NIRS聯(lián)用技術，并對此方法進行了系統(tǒng)方法學考察。建立了保健品中添加違禁化學藥西地那非、那紅地那非快速定性定量分析模型，經(jīng)驗證集樣品進行模型驗證與評價，定性模型可以較好判斷保健品中是否添加上述違禁化學藥物，判斷正確率100%；定量模型可以較準確的預測出添加西地那非、那紅地那非的含量，含量預測范圍寬，分別為5.25～262.5、5.15～257.5 μg/μL，在10保健品預測結(jié)果中平均相對偏差分別為1.86%、1.96%，其預測結(jié)果均達到較好的效果，能夠滿足實際快檢的需要。在實際工作中應用TLC-NIRS聯(lián)用技術破獲多批添加超劑量違禁化藥西地那非的性保健品。

本研究選用那非類化藥作為研究對象，因在性保健產(chǎn)品中那非類化藥效果確切、價格低廉且易獲得，是不法廠家首選的添加對象[3]。此外，此類性保健化藥要達到預期效果，有效劑量為50～100 mg/次，長期超劑量服用會造成嚴重的肝腎損傷及永久性性喪失等風險[18]。采用TLC-NIRS模型預測性保健品中是否添加那非類化藥具有一定的可行性與研究價值。

本文利用目前實驗平臺上已有的分析技術及儀器進行組合聯(lián)用，應用到實際藥檢中具有很好的效果。開發(fā)的TLC-NIRS聯(lián)用技術，在面對保健品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量參差不齊、生產(chǎn)品種繁多、輔料來源難統(tǒng)一、非法添加嚴重等問題方面具有很好的應用前景。此聯(lián)用技術應用理論與實踐研究為開發(fā)TLC-NIRS聯(lián)用儀器設備提供了科學依據(jù)。