海風藤中酰胺生物堿類成分研究

朱 瑩，孔江波，孫潘婷，孫彥君,2，馮衛生,2，李玉賢,2*，陳 輝,2*

1河南中醫藥大學藥學院；2呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，鄭州 450046

海風藤為胡椒科Piperaceae胡椒屬植物風藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi的干燥藤莖，主產于我國臺灣、云南、廣東等地。海風藤味辛、苦，性微溫，歸肝經，具有“祛風濕，通經絡，止痹痛”等功效，臨床上用于治療風寒濕痹，肢節疼痛等癥[1,2]。藥理研究表明海風藤在治療阿爾茲海默癥，抗炎，鎮痛和器官缺血再灌注等方面具有顯著的藥用價值[3-7]。化學成分研究發現海風藤中主要含有新木脂素類、生物堿類、黃酮類、揮發油等成分[8,9]，其中酰胺生物堿類成分是該屬植物中的特征成分，且含量較大，在海風藤中亦有報道。目前國內外學者對海風藤的研究主要集中于其中的新木脂素類及其在治療和預防阿爾茲海默癥、缺血性腦血管病等方面[3-7]，但對于該植物中的酰胺生物堿類化合物報道較少。帕金森病(PD)是僅次于阿爾茲海默癥第二常見的神經退行性疾病，近年來研究發現含有海風藤的一些中藥復方或制劑對于PD具有較好的改善作用[10-12]，但缺少相應的化學成分研究基礎。基于以上問題，我們開展了海風藤中酰胺生物堿類成分的研究，并采用MPP+致損傷PC12細胞構建PD細胞模型，對分離得到的化合物進行體外神經保活性篩選，為后續該植物活性成分的開發和利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Bruker maxis HD 型飛行時間質譜(德國Bruker公司)；N-1000型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHB-B 95A型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DFZ-3型真空干燥箱(上海醫用恒溫設備廠)；賽譜銳思LC 52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP 5030型半制備型高壓輸液泵，UV 200型紫外檢測器，Easychrom型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A，250 mm × 20 mm，5 μm)；Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech公司)；ODS(40～60 μm YMC)；甲醇，色譜純(天津市四友精細化學品有限公司)；其他試劑均為分析級；薄層層析硅膠選用10～40 μm的粒徑，以0.5% CMC-Na制板，陰干，105 ℃活化0.5 h；MPP+(Sigma)，MTS(Promega)。

海風藤于2018年6月采購于安徽亳州藥材市場，經河南中醫藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物風藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi的干燥藤莖，標本存放于河南中醫藥大學中藥化學研究室(標本號ID-20180609I)。

1.2 提取與分離

海風藤藥材粗粉(40 kg)，采用二氯甲烷冷浸提取，每次24 h，共提取3次，繼續用甲醇冷浸提取；提取液經減壓濃縮，得到二氯甲烷部位浸膏600 g，甲醇部位浸膏450 g。將二氯甲烷部位總浸膏進行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮系統(100∶0→0∶100)梯度洗脫，共分離得到13個流分(Fr.1～13)。流分Fr.7經中壓柱色譜分離，依次用甲醇-水(30%→100%甲醇)梯度洗脫，得6個亞流分(Fr.7-1～Fr.7-6)。將Fr.7-3經半制備型HPLC制備(甲醇-水70%)制備得化合物9(20 mg，tR= 28 min)，將Fr.7-5經硅膠柱色譜分離(石油醚：丙酮)，再經半制備型HPLC制備得化合物8(2.6 mg，tR= 22 min)。流分Fr.8經中壓柱色譜分離，依次用甲醇-水(30%→100%甲醇)梯度洗脫，得7個亞流分(Fr.8-1～Fr.8-7)。將Fr.8-3經硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結合制備型HPLC制備(甲醇-水 60%)得化合物1(5 mg，tR= 40 min)、2(6 mg，tR= 66 min)、3(14 mg，tR= 60 min)、4(10 mg，tR= 80 min)、6(8 mg，tR= 120min)。將Fr.8-4經硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結合制備型HPLC制備(甲醇-水 70%)得化合物7(2.5 mg，tR= 68 min)、11(1.5 mg，tR= 57 min)。將Fr.8-6經硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結合半制備型HPLC制備(甲醇-水 90%)得化合物5(2.6 mg，tR= 26 min)、10(3 mg，tR= 25 min)。將甲醇部位總浸膏進行硅藻土柱色譜分離，得石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇4部位樣品。將乙酸乙酯部位總浸膏進行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮系統(50∶1→0∶100)梯度洗脫，共分離得到8個流分(Fr.E1～E8)。將組分Fr.E3經凝膠柱色譜分離，再結合制備型HPLC制備(甲醇-水 75%)得化合物12(5.5 mg，tR= 68 min)、13(3.5 mg，tR= 57 min)。

1.3 體外神經保護活性測試

PC12低分化細胞置于10%FBS及100 U/mL的DMEM高糖雙抗的培養基中，并在含5% CO2的37 ℃培養箱中培養至合適數量，用胰酶消化制成細胞懸液吸至15 mL離心管中，800 rpm，離心5 min后棄上清，加入新的完全培養基5 mL，用移液器吹打10次，盡量吹散細胞，取0.02 mL細胞懸液加入到細胞計數板中，計數。將細胞濃度調整至1×105個/ mL接種到96孔板繼續培養。23 h后，吸出培養基，根據加入成分不同分成3組，每組平行重復3次[13]。空白對照組：只加入新培養基；模型組：加入培養基及終濃度750 μM MPP+，24 h后，加入MTS，2 h后，讀值檢測；藥物組：加入培養基及終濃度20 μM化合物，再加終濃度750 μM MPP+，24 h后，加入MTS，2 h后，讀值檢測。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1無色針狀結晶(CHCl3)；mp.133.2 ℃；UV光譜中顯示該化合物在甲醇溶液中的最大吸收為276 nm；IR光譜顯示有胺基(3 315 cm-1)和共軛羰基(1 648 cm-1)等特征吸收峰；HR-ESI-MS：m/z238.180 9 [M + H]+(計算值為238.180 2)，確定化合物1的分子式為C14H23NO2，計算不飽和度為4。1H NMR譜中(表1)，低場區顯示有2組烯烴質子信號δH6.26(1H，d，J= 14.6 Hz，H-2)，7.29(1H，dd，J= 14.6，11.6 Hz，H-3)和7.20(1H，dd，J= 15.1，11.6 Hz，H-4)，6.46(1H，d，J= 15.1 Hz，H-5)，根據其偶合常數推測分子中存在2個反式雙鍵。此外，δH5.84處的質子信號，結合HSQC譜，推測為胺基活潑質子信號。高場區δH3.21～1.36之間出現4個亞甲基質子信號δH3.21(2H，t，J= 6.3 Hz，H-1′)，2.59(2H，t，J= 7.3 Hz，H-7)，1.63(2H，m，H-8)，1.36(2H，m，H-9)和1個次甲基質子信號δH1.84(1H，m，H-2′)。此外，高場區還顯示3個甲基質子信號δH0.94(6H，d，J= 6.2 Hz，H-3′，4′)，0.92(3H，t，J= 7.3 Hz，H-10)。13C NMR譜中共顯示14個碳信號，進一步結合DEPT和HSQC譜確定化合物1顯示有2個羰基碳信號δc200.3(C-6)、165.1(C-1)，4個雙鍵碳信號，4個亞甲基碳信號，1個次甲基碳信號以及3個甲基碳信號。綜合以上光譜數據信息，推測化合物1為酰胺類生物堿(見圖1)。

圖1 化合物1～13的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

1H-1H COSY譜中(圖2)H-3與H-4有相關，說明分子中的2個反式雙鍵以1，3共軛的形式存在；H-7與H-8、H-8與H-9、H-9與H-10存在相關，證明該化合物存在1個正丁基片段；H-1′與H-2′、-NH-，H-2′與H-3′、4′存在相關，證明該化合物有異丁基片段，且與氨基相連形成-NH-CH2-CH-(CH3)2結構片段。HMBC譜(見圖2)中，H-3與δC165.1處的羰基碳(C-1)及C-5有明顯遠程相關，H-4與δC200.3處羰基碳(C-6)及C-2有遠程相關，說明這2個羰基碳分別與1，3共軛雙鍵上的C-2和C-5相連；H-7與C-9有相關，H-8與羰基碳C-6及C-10有相關，證明6位羰基碳與正丁基片段通過C-7相連；此外，H-1′與-3′、C-4′及C-1有相關，H-2′與C-4′有相關，證明-NH-CH2-CH-(CH3)2結構片段與1位羰基碳相連。綜上所述，確定該化合物為(2E,4E)-N-isobutyl-6-oxodeca-2,4-dienamide。其1H NMR和13C NMR數據見表1。化合物1的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的結構和關鍵1H-1H COSY、HMBC相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR波譜數據(500和125 MHz，CDCl3)Table 1 1H NMR and 13C NMR data ofcompound 1 (500 and 125 MHz,CDCl3)

圖3 化合物2的結構和關鍵1H-1H COSY、HMBC、NOE相關Fig.3 Key 1H-1H COSY,HMBC and NOE correlations of compound 2

化合物3無色油狀物；ESI-MS：m/z256 [M + H]+，分子式為C14H25NO3。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.23(1H，dd，J= 12.1，9.1 Hz，H-1′a)，2.74(1H，m，H-2a)，2.49(2H，m，H-1′a，2b)，2.48(2H，m，H-6)，2.30(1H，ddd，J= 14.3，10.3，4.9 Hz，H-3a)，2.11(1H，ddd，J= 14.3，10.3，7.0 Hz，H-3b)，1.87(1H，m，H-2′)，1.67(1H，m，H-7a)，1.65(1H，m，H-7b)，1.36(1H，m，H-9a)，1.30(1H，m，H-8a)，1.29(1H，m，H-9b)，1.28(1H，m，H-8b)，0.90(3H，t，J= 6.8 Hz，H-10)，0.88(6H，d，J= 6.8 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：209.3(C-5)，175.0(C-1)，92.7(C-4)，47.8(C-1′)，34.8(C-6)，31.2(C-8)，30.2(C-3)，29.2(C-2)，27.9(C-2′)，23.4(C-7)，22.4(C-9)，20.3(C-3′)，20.4(C-4′)，13.8(C-10)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-4-hexanoyl-4-hydroxypyrrolidin-1-one。

化合物5白色無定形粉末；ESI-MS：m/z196 [M + H]+，分子式為C12H21NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.19(1H，dd，J= 15.0，10.4 Hz，H-3)，6.10(1H，m，H-4)，6.10(1H，m，H-5)，5.75(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.17(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.13(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.79(1H，m，H-2′)，1.45(2H，m，H-7)，0.92(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.4 Hz，H-8)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.3(C-1)，143.0(C-3)，141.3(C-5)，128.4(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，35.0(C-6)，28.6(C-2′)，22.0(C-7)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，13.7(C-8)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E-octadienamide。

化合物6無色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z224 [M + H]+，分子式為C14H25NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.20(1H，dd，J= 15.0，10.3 Hz，H-3)，6.11(1H，m，H-4)，6.11(1H，m，H-5)，5.78(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.18(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.15(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.30(4H，m，H-8，9)，0.94(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.0 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.2(C-5)，141.3(C-3)，128.2(C-4)，121.8(C-2)，46.9(C-1′)，32.9(C-6)，31.4(C-8)，28.5(C-7)，28.6(C-2′)，22.5(C-9)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.0(C-10)。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物為pellitorine。

化合物7無色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z252 [M + H]+，分子式為C16H29NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 15.0，10.2 Hz，H-3)，6.12(1H，m，H-4)，6.12(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.19(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.17(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.31(8H，m，H-8～11)，0.95(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 6.8 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-5)，141.4(C-3)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，33.0(C-6)，31.8(C-8)，29.1(C-7)，29.1(C-9)，28.8(C-10)，28.6(C-2′)，22.6(C-11)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-12)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobuty-2E,4E-dodecadienamide。

化合物8白色無定形粉末；ESI-MS：m/z336 [M + H]+，分子式為C22H41NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 15.0，10.1 Hz，H-3)，6.12(1H，m，H-4)，6.12(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.19(2H，t，J= 6.5 Hz，H-1′)，2.15(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.28(20H，m，H-8～17)，0.94(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.0 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-3)，141.4(C-5)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，33.0(C-6)，31.9(C-16)，29.5(C-7)，29.2～29.7(C-9～15)，28.8(C-8)，28.6(C-2′)，22.7(C-17)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-18)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E-octadecadienamide。

化合物9無色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z238 [M + H]+，分子式為C15H27NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 14.9，10.7 Hz，H-3)，6.11(1H，m，H-4)，6.11(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 14.9 Hz，H-2)，3.18(2H，m，H-1′)，2.16(2H，m，H-6)，1.60(1H，m，H-2′)，1.42(2H，m，H-7)，1.27(6H，m，H-8，9，3′)，0.94(6H，m，H-4′，5′)，0.90(3H，t，J= 7.4 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.5(C-1)，143.3(C-5)，141.4(C-3)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，45.2(C-1′)，32.9(C-6)，31.4(C-8)，35.1(C-2′)，28.5(C-7)，27.0(C-3′)，22.5(C-9)，17.2(C-5′)，14.0(C-10)，11.3(C-4′)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物為N-(2′-methylbutyl)-2E,4E-decadienamide。

化合物10黃色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z334 [M + H]+，分子式為C22H39NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.19(1H，dd，J= 15.0，10.2 Hz，H-3)，6.09(1H，m，H-4)，6.09(1H，m，H-5)，5.74(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，5.38(2H，m，H-12，13)，3.16(2H，t，J= 13.0，6.7 Hz，H-1′)，2.14(2H，m，H-6)，1.96(4H，m，H-11，14)，1.80(1H，m，J= 13.4，6.7 Hz，H-2′)，1.41(2H，m，H-7)，1.30(6H，m，H-15～17)，1.29(6H，m，H-8～10)，0.93(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.88(3H，t，J= 7.0 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-3)，141.4(C-5)，130.5(C-12)，130.2(C-13)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，32.6(C-6)，32.6(C-11)，32.5(C-14)，32.5(C-16)，29.6(C-10)，29.3(C-15)，29.1(C-9)，29.0(C-8)，28.9(C-7)，28.6(C-2′)，22.6(C-17)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-18)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E,12Z-octadecatrienamide。

化合物11無色結晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z226 [M + H]+，分子式為C14H27NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.85(1H，m，H-3)，5.77(1H，d，J= 15.2 Hz，H-2)，3.18(2H，t，J= 6.5 Hz，H-1′)，2.19(2H，q，J= 6.9 Hz，H-4)，1.81(1H，m，H-2′)，1.59(6H，m，H-5～7)，1.30(4H，m，H-8，9)，0.95(6H，d，J= 6.5 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.3(C-1)，144.8(C-3)，123.5(C-2)，46.8(C-1′)，32.0(C-4)，31.8(C-8)，29.1(C-5)，29.1(C-6)，28.6(C-2′)，28.3(C-7)，22.6(C-9)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，13.8(C-10)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E-decenamide。

化合物12黃色結晶(MeOH)；ESI-MS：m/z276 [M + H]+，分子式為C16H21NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(1H，m，H-3)，6.69(2H，overlap，H-2′′，6′′)，6.64(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4′′)，5.90(1H，d，J= 15.4 Hz，H-2)，5.87(2H，s，-OCH2O-)，3.03(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1′)，2.68(2H，t，J= 7.5 Hz，H-5)，2.45(2H，q，J= 7.5 Hz，H-4)，1.76(1H，m，H-2′)，0.80(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.3(C-1)，147.7(C-3′′)，145.9(C-4′′)，143.1(C-3)，134.9(C-1′′)，123.9(C-2)，120.9(C-6′′)，108.7(C-2′′)，107.6(C-5′′)，100.7(-OCH2O-)，46.5(C-1′)，34.0(C-5)，33.8(C-4)，28.3(C-2′)，19.1(C-3′，4′)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物為二氫蓽茇明寧堿。

化合物13無色結晶(MeOH)；ESI-MS：m/z302 [M + H]+，分子式為C18H23NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.90(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′′)，6.79(2H，m，H-3，6′′)，6.71(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′′)，6.34(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.08(1H，m，H-6)，5.97(1H，d，J= 15.4 Hz，H-2)，5.90(2H，s，-OCH2O-)，3.04(2H，d，J= 6.9 Hz，H-1′)，2.35(4H，m，H-4，5)，1.78(1H，m，H-2′)，0.90(6H，d，J= 6.8 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.7(C-1)，147.5(C-3′′)，147.5(C-4′′)，143.3(C-3)，132.1(C-1′′)，130.3(C-7)，126.9(C-6)，123.8(C-2)，120.1(C-6′′)，107.6(C-5′′)，104.9(C-2′′)，100.9(-OCH2O-)，46.5(C-1′)，31.6(C-5)，31.4(C-4)，28.3(C-2′)，19.1 (C-3′，4′)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物為風藤酰胺。

2.2 體外神經保護活性測試結果

采用MPP+損傷PC12細胞模型對化合物1～10進行活性測試，檢測結果顯示：與空白對照組比較(100%)，模型組的細胞存活率顯著降低(68.60%)；與模型組比較，化合物6在20 μM時，細胞的存活率為73.78%，對MPP+誘導的神經細胞損傷有非常顯著的保護作用(P< 0.01)，其余化合物對MPP+誘導的神經細胞損傷無明顯保護作用。

3 討論

本實驗從海風藤二氯甲烷部位共分離得到酰胺類生物堿13個，其中化合物1為新化合物，化合物2為新天然產物，化合物3～7、9、10為首次從該植物中分離得到。藥理實驗研究表明化合物6在20 μM時，對MPP+誘導的PC12細胞損傷具有顯著的保護作用(P< 0.01)，提示其對于帕金森病具有潛在的治療作用。本研究不僅進一步豐富了海風藤中酰胺生物堿類成分的結構多樣性，對海風藤中酰胺類生物堿在治療和預防神經退行性疾病方面的研究亦具有一定的參考價值，同時對該屬植物后續化學成分及生物活性的研究具有一定的借鑒作用。