云南分心木提取物對小鼠高尿酸血癥模型治療作用研究

張 偉，陳雪潔，劉 蓉，沈 磊，田新雁，姜 北*

1大理大學藥物研究所；2大理大學基礎醫學院，大理 671000

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種尿酸(uric acid，UA)合成增加和(或)尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病。高尿酸血癥是引起痛風性關節炎，痛風性腎病等疾病的危險因素[1]。近年來，全球痛風的發病率持續提升[2-4]。目前對HUA治療的西藥有別嘌醇、苯溴馬隆和非布司他等，雖療效尚可，但均伴有肝腎毒性、藥疹及耐藥性等副作用[5]。因此，探尋有效且毒副作用小的藥物具有比較重要的意義。

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物，分心木(Diaphragma Juglandis Fructus，DJF)，為核桃果實子房室的木質中隔，性平，無毒，具有健脾固腎的功效[6]。云南是我國核桃的起源地[7]，擁有獨具特色的漾濞泡核桃(JuglanssigillataDode)，漾濞彝族自治縣因此也享有“中國核桃之鄉”的美譽，2020年產量達到5.7萬噸，綜合產值10億元以上，成為當地經濟支柱產業。本課題組作為國內最早從事相關研究的科研團隊之一，曾于2009-2012年間對云南漾濞泡核桃分心木進行了初步的研究，并且從中分離鑒定包括沒食子酸、大黃素、二氫槲皮素等近二十個成分，首次對核桃分心木中所含化學成分有了初步的認識[8]。現代藥理研究表明，核桃分心木有補腎、抗氧化、抗菌、抗炎、調節免疫及抑制黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)等功效[9-11]，但核桃分心木對高尿酸血癥的作用迄今卻尚未見有報道。本文通過云南產核桃分心木干預HUA小鼠模型實驗，探究分心木提取物對HUA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2019-0004。動物實驗完全依照大理大學醫學倫理委員會及大理大學藥學院實驗動物管理委員會的相關規定進行(批準文號：MECDU-202010-7)。

1.1.2 藥物和試劑

云南產分心木購于云南省大理市漾濞縣。白介素1β、腫瘤壞死因子α(批號：20210312)購于南京建成生物工程研究所；尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、總蛋白定量測試盒(批號：20201028)購于南京建成生物工程研究所；別嘌醇、腺嘌呤、氧嗪酸鉀(批號依次為C1155486、C10984047、C11528491)購于上海麥克林〗生化科技有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(批號：F20080523)購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 實驗儀器

Varisoskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世科爾科技有限公司)；MCO-18AIC CO2孵育箱(日本三洋電器公司)；Tissuelyser-L多樣品組織研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)；BX53F正置顯微鏡(Olympus公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；H6小鼠獨立通氣籠(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)；Master-S30UVF純水機(上海和泰儀器有限公司)。

由于α-姜黃烯、α-姜烯和姜黃新酮等特征性共有峰對照品不易得，所以本實驗選用β-石竹烯（S峰）為參照物，依據國家頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》，通過采用不同批次黃絲郁金藥材樣品，建立對照指紋圖譜，根據對照指紋圖譜的特征以及其參照峰（β-石竹烯），確定了22個共有峰。其中23號色譜峰雖然在每批樣品中也都存在，而且含量約占黃絲郁金揮發油的50%，卻并不是18批樣品的共有峰，原因是23號色譜峰可能是由于芳基姜黃酮和姜黃酮未達到分離而共同形成的一個色譜峰，實驗中曾考察了不同色譜柱和不同升溫程序，但最終仍然未使之分離，如何優化實驗條件使之完全分離有待進一步研究。

1.2 方法

1.2.1 供試樣品的制備

取干燥供試品，粉碎后過120目篩，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸餾瓶中，加入500 mL蒸餾水，85 ℃回流提取3次，冷卻后過濾，合并濾液，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥12.5 g)得分心木水提物樣品DJF-W。將DJF-W樣品分別用強酸型陽離子交換樹脂(FPC14Na)和強酸型苯乙烯系陽離子交換樹脂(732型)處理，得去離子樣品DJF-S1和樣品DJF-S2。取分心木干粉按1∶3(m/V)比例加入75%乙醇，冷浸提取24 h，以相同條件提取5次，過濾，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥7.8 g)得分心木醇提取物樣品DJF-E。

1.2.2 高尿酸血癥小鼠模型的建立

依據文獻[12,13]，對昆明種雄性小鼠連續灌胃造模誘導劑氧嗪酸鉀(oxygen oxazine acid potassium，OXO)及腺嘌呤(adenine，Ade)可構建小鼠高尿酸血癥模型。結合文獻[14,15]并通過預實驗對誘導劑劑量及誘導時間進行了探索，結果顯示以OXO-250 mg/kg + Ade-100 mg/kg的CMC-Na混懸液連續誘導21天，模型組小鼠腎臟出現明顯病變(見圖1)，表面出現褶皺、體積變小、顏色明顯變淺，從第8天開始，給予誘導劑之后灌胃別嘌醇(10 mg/kg)治療，連續14天，別嘌醇組小鼠腎臟病變明顯減輕(見圖1)。小鼠體內存在尿酸酶，影響高血尿酸的維持狀態，結合文獻[15,16]中給予誘導劑后血尿酸含量隨時間變化的趨勢和對給予誘導劑后適合的給藥時間的考察結果，結果表明：控制誘導劑和治療藥時間間隔1 h，末次給藥后1 h取血檢測血尿酸含量時，模型組血尿酸含量顯著高于正常組。運用此方案研究分心木提取物降尿酸活性。

圖1 腎臟變化情況Fig.1 The pathological condition of the renal注：從左到右依次為正常組、模型組、別嘌醇組。Note:From left to right,they are normal group,model group and allopurinol group.

1.2.3 分心木提取物對高尿酸血癥小鼠的影響

1.2.3.1 動物分組、給藥和處理

取110只昆明種雄性小鼠，分為11組(每組10只)，分別為正常組(normal group)、模型組(model group)、別嘌醇組(allopurinol group，10 mg/kg)；DJF-W高(H)、低(L)劑量組(2、1 g/kg)；DJF-E高、低劑量組(2、1 g/kg)；DJF-S1高、低劑量組(2、1 g/kg)；DJF-S2高、低劑量組(2、1 g/kg)(均為凍干粉劑量)。除正常組外，其余各組小鼠分別灌胃誘導劑，正常組給予等體積的CMC-Na，連續21天。前7天在給予造模誘導劑后1 h，各組灌胃蒸餾水；第8天，在給予誘導劑后1 h，正常組繼續灌胃蒸餾水、樣品組給予相應樣品溶液、別嘌醇組給予別嘌醇10 mg/kg，連續14天[17]。

1.2.3.2 取材及生化指標測定

末次給藥治療后1 h，各組小鼠眼球后靜脈叢取血，室溫靜置30 min后，3 500 rpm離心15 min，收集上層血清，置于-20 ℃備用，按照試劑盒說明書測定尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量；取肝臟，按照試劑盒說明書測定黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性；取腎組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重，每只小鼠取50 mg左右組織，按1∶9的比例加入0.9%生理鹽水，機械勻漿。3 500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的腎臟組織勻漿。按試劑盒說明書應用ELISA法測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的水平。

1.2.3.3 腎組織形態學病變檢測

取相同部位腎組織，經生理鹽水沖洗后，常規取材、脫水、包埋、制片、HE染色后，在光學顯微鏡下觀察并描述。

1.2.4 數據處理

數據采用mean ± SD在圖像上表示，SPSS 20.0軟件進行統計學分析，進行單因素方差分析(One-Way ANOVE)比較組間差異，P< 0.05認為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 水提物樣品元素差異分析

通過檢測去離子樣品和水提物樣品中無機元素的含量，對比得出兩種去離子樣品無機元素去除率見表1，水提物、S1樣品、S2樣品三者之間無機元素含量存在差異。與S2樣品相比，S1樣本Zn、Ca、Mn、Cu、Mg元素的去除率較高，Fe和Cr較低。

表1 兩種去離子樣品無機元素的去除率Table 1 Removal rate of inorganic elements in two deionized samples

2.2 分心木提取物對高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用

分心木提取物對小鼠血清中UA水平以及肝臟中XOD活性的影響情況見圖2。與正常組比較，模型組小鼠血清UA水平及肝臟XOD活性明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽性藥別嘌醇顯著降低小鼠血清UA水平及肝臟XOD活性(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量均能不同程度的降低UA的水平和XOD的活性，其中分心木水提物高劑量及醇提物高劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，但均弱于別嘌醇；去離子樣品的效果相對較弱；各樣本組的效應基本呈現一定的量效關系。

圖2 分心木提取物對HUA小鼠模型血清UA和肝臟XOD的影響Fig.2 Effect of the extracts of DJF on the serum UA and XOD activity of the liver in HUA mice注：A：正常組；B：模型組；C：別嘌醇組；D：DJF-W(H)組；E：DJF-E(H)組，F：DJF-S1(H)組；G：DJF-S2(H)組；H：DJF-W(L)組；I：DJF-E(L)組；J：DJF-S1(L)組；K：DJF-S2(L)組；別嘌醇劑量為10 mg/kg，分心木提取物高、低劑量為2、1 mg/kg；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Allopurinol group;D:DJF-W(H) group;E:DJF-E(H) group;F:DJF-S1(H) group;G:DJF-S2(H) group;H:DJF-W(L) group;I:DJF-E(L) group;J:DJF-S1(L) group;K:DJF-S2(L) group.The dose of allopurinol was 10 mg/kg;the high dose and low dose of DJF extracts were 2 and 1 mg/kg.Compared with the normal group, *P < 0.05,**P < 0.01;Compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01;the same below.

2.3 分心木提取物對高尿酸血癥小鼠腎組織及炎癥因子的影響

2.3.1 腎臟功能指標

分心木提取物對小鼠血清中Cr和BUN水平的影響情況見圖3。與正常組相比較，模型組小鼠血清Cr及BUN水平明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽性藥別嘌醇顯著降低小鼠血清Cr及BUN水平(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量組均能不同程度的降低這兩個指標，其中分心木醇提物高、低劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，但弱于別嘌醇；水提物的降低效果次之，去離子樣品效應最弱，各樣本組的效應基本呈現一定的量效關系。

圖3 分心木提取物對HUA小鼠模型Cr和BUN水平的影響 Fig.3 Effect of the extracts of DJF on the level of Cr and BUN in HUA mice

2.3.2 腎組織炎癥因子的測定

分心木提取物對小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平的影響情況見圖4。與正常組相比較，模型組小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽性藥別嘌醇顯著降低小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量組均能不同程度的降低這兩個指標，其中云南分心木醇提物高、低劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，且強于別嘌醇；水提物效應的效果次之，去離子樣品最弱，各樣本組的效應基本呈現一定的量效關系。

圖4 分心木提取物對HUA小鼠模型IL-1β和TNF-α水平的影響 Fig.4 Effect of the extracts of DJF on the level of IL-1β and TNF-α in HUA mice

2.3.3 腎組織形態學病變檢測

分心木提取物對小鼠腎臟形態學的影響如圖5。將腎組織切片用HE染色，于400倍數不同視野下對各組進行圖片采集，鏡下顯示正常組(n=5)腎小管邊界清晰，小管上皮細胞排列整齊，緊密。模型組(n=5)有炎癥細胞浸潤，較多細胞出現腫脹，腎小管擴張明顯且細胞邊界不明顯，較多的腎小管壞死，腎小球嚴重損傷，表明氧嗪酸鉀和腺嘌呤可對腎臟結構造成嚴重的破壞。與模型組相比，陽性藥組(n=5)炎癥細胞浸潤明顯減少，腎小管擴張程度減輕，細胞形態正常，表明別嘌醇的治療效果明顯；分心木各提取物組(n=5)表現不同程度的病理變化，其中圖E病變程度最輕，圖D次之，余下各組具有明顯的結構破壞，表明分心木高劑量的水提取物及醇提物可有效減輕腎臟結構的損傷，其余劑量樣品治療效果相對較差。

圖5 小鼠腎臟病理切片(×400，標尺：50 μm)Fig.5 Pathological section of mouse renal (×400,scale:50 μm)注：黑色箭頭指腎小管壞死；白色箭頭指腎小管擴張；黑色圓圈指炎癥細胞浸潤；黑色方框指腎小球損傷。Note:The black arrows indicate renal tubular necrosis;The white arrows indicate renal tubules dilate;The black circles indicate inflammatory cell infiltration;The black box indicates glomerular injury.

3 討論與結論

尿酸(UA)是嘌呤類化合物代謝的終產物，黃嘌呤氧化酶是其代謝過程中的關鍵酶，因此其活力可以作為評價機體生成尿酸能力的關鍵性指標[18]。腎臟是人類代謝UA的主要器官，UA易形成尿酸結晶在腎臟中沉積，可引發尿酸性腎損傷(uric acid nephropathy，UAN)[19]；并且可刺激強烈的炎癥反應，使得腎臟結構和功能異常[20]。

人類在不斷進化的過程中尿酸酶的基因突變導致尿酸酶失活，使得尿酸成為了嘌呤類化合物代謝的最終產物。與人類不同，嚙齒類動物可將尿酸通過尿酸酶進一步分解，更易排出體外[21]。本研究給予昆明種小鼠氧嗪酸鉀和腺嘌呤，通過增加來源和抑制去路的方式聯合干預血尿酸水平，嚴格控制給予誘導劑后的取血時間，復制出既血尿酸水平顯著升高且有腎損傷的動物模型，接近人類患有高尿酸血癥的狀態。

傳統民族民間醫藥記載，分心木有固澀收斂、健脾固腎等功效[6]。近年來，分心木用途日趨廣泛，研究也越來越多。Jing等[11]對分心木中的成分進行了體外抑制XOD活性的探究，結果表明部分其成分具有良好的抑制活性。結合抑制XOD活性和炎癥反應是治療HUA引發腎損傷的有效靶點以及分心木的藥用記載和現代研究，本課題組進行了分心木對高尿酸血癥小鼠治療作用的探究。結果表明，與模型組相比，分心木醇提物2 g/kg組的小鼠肝臟中XOD的活性水平明顯下調；血清中的UA含量也明顯下降。XOD是生成UA的關鍵控速酶，直接決定UA的生成量，表明云南分心木醇提物可以通過抑制XOD的活性，起到降低血UA含量的作用。尿酸結晶及游離態的尿酸可協同影響炎癥因子的表達，直接影響促炎癥細胞因子白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等其他炎癥因子的生成，IL-1β生成過量時可誘導腎小球硬化及系膜細胞發生增殖[22]，大量的TNF-α也會加劇炎癥反應。云南分心木醇提物組的小鼠腎臟組織的炎癥因子TNF-α、IL-1β和血清中Cr、BUN的含量明顯低于模型組，表明分心木醇提物有清除炎癥因子的功效且優于別嘌醇，也可下調間接表現腎功能的指標Cr、BUN[23]，改善腎臟的功能。

微量元素生理生化功能非常廣泛，是機體正常活動的基礎[24]。例如，鋅元素是機體必需的營養素和必要的還原劑[25]，也可在生殖和泌尿系統中發揮重要作用[26]。課題組前期研究結果顯示，云南分心木含有Cu、Zn、Fe、Mn、Mg等多種微量元素，為了驗證云南分心木中的微量元素對治療HUA是否有作用，本研究將分心木水提物去除無機元素后的樣品同水提物進行了藥效學對比，結果顯示，強酸型陽離子交換樹脂(FPC14Na)處理的去離子提取物DJF-S1中鋅元素的去除效果明顯高于強酸型苯乙烯系陽離子交換樹脂(732型)處理的去離子提取物DJF-S2，同劑量下DJF-S1樣品對HUA小鼠的治療效果弱于DJF-S2樣本，且兩種去離子樣本對HUA小鼠的治療效果均弱于DJF-W樣本，表明分心木中富含的鋅元素可能是治療高尿酸血癥的重要成分，本研究為深入研究微量元素作用于高尿酸血癥的機制提供方向。

綜上所述，分心木醇提物具有改善腎功能、抑制XOD活性的作用以及抗炎的功效，一定程度上可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平。目前西藥治療HUA有一定的優勢，但不可忽視它的不良反應，而植物藥在安全性高、多靶點協同治療方面有明顯優勢，本文研究結果為后續的機制研究提供了重要的線索，明確了研究方向，對后期尋找高效低毒的有效成分提供了依據，同時也為分心木的開發利用提供了新的思路。