基于標準湯劑對化濕止咳湯質量標準的研究

辛加敏 阮婧華 范東生 蘇松柏 萬明香 查 鑫 史耀輝 夏 青

貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001

隨著中醫藥現代化的發展，中藥從原有的湯劑、膏、丹、丸、散等劑型到現有的片劑、膠囊劑、顆粒劑等[1]，湯劑都扮演著重要的角色，在疾病預防、治療、診斷，都有著廣泛的臨床應用，在慢性疾病的治療過程中，有著舉足輕重的地位。此外，湯劑由于廉價、易得、煎煮方便等優點，是患者常選的劑型之一。

但是，湯劑在大量使用時，特別是常用處方，缺乏質量控制標準，易造成療效降低等情況[2]。因此，對使用量大的處方設定一定的參數如出膏率、pH、含量測定等進行評價的研究，對湯劑的發展有著重要意義?；瘽裰箍葴从谟衿溜L散和藿香正氣散兩個古方加減而成，主要由廣藿香、山藥、白術、法半夏、炙甘草、炒紫蘇子六味中藥組成[3]，該方煎煮后散發清香之味，治療濕證效果較佳，患者服用順應性好，受廣大患者歡迎。在保證安全性及療效的前提下，將其研究成為醫療機構制劑，不僅給患者使用帶來方便，還降低患者用藥成本。

目前，醫療機構制劑質量控制主要采用薄層鑒別、單一指標成分定量等，該類方法缺乏中醫藥整體性的特點?！皹藴蕼珓笔窃谥嗅t藥理論指導下，按照臨床湯劑煎煮方法，采用適當方法制得，可作為制劑與臨床湯劑標準參照物[4]。因此，為建立化濕止咳湯的特征性質量標準，本研究遵循原始湯劑特點，參照標準湯劑研究方法，通過對湯劑的pH、出膏率、指標成分定性定量、指紋圖譜研究，為該制劑的質量控制提供可靠方法，保證與傳統湯劑的一致性。使煎煮后的湯劑更加合理、規范、科學、從而發揮更好的療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相(美國waters公司)；MS105DU十萬分之一的電子分析天平(美國METTLER TOLEDO)；Milli-Q純水機(法國默克)，電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)；pH測定儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

1.2 試藥與材料 甘草苷(批號：111610-201908)購買于中國食品藥品檢定研究院，廣藿香和炒紫蘇子(貴陽同仁堂)；山藥、白術、法半夏(四川千方藥業)；炙甘草(四川博仁藥業)，經我院陳秀敏主任藥師鑒定均為正品，研究樣品山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaOppositaThunb.的干燥根莖山藥；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizaUralensisFisch、脹果甘草GlycyrrhizaInflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根炮制品；半夏為天南星科植物半夏PinelliaTernata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖的炮制品；紫蘇子為唇形科植物紫蘇PerlaalFrutescens(L.)Britt.的干燥成熟果實；廣藿香為唇形科植物廣藿香PogostemonCablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分；白術為菊科植物白術AtractylodesMacrocephalaKoidz.的干燥根莖。

1.3 化濕止咳湯劑的制備 根據國家中醫藥管理局《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，按化濕止咳湯處方分別稱取各味藥材共15批，第一次加水180 mL，浸泡30 min，煎煮20 min；第二次加水140 mL，煎煮20 min，合并煎液，即得。

2 方法與結果

2.1 出膏率及pH測定 分別精密吸取15批化濕止咳湯20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，按照《中國藥典》2015版，置已恒重的蒸發皿中，于105 ℃干燥3 h，移置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，得出15批化濕止咳湯出膏率在15.98%～24.12%之間；再分別精密吸取混合均勻的湯劑40～50 mL，用pH計測定pH值，15批化濕止咳湯pH值5.30～5.91之間。

2.2 TLC法對白術、甘草的鑒別

2.2.1 白術的鑒別 取本品40 mL，用乙酸乙酯振搖淬取3次，每次25 mL，合并淬取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取白術對照藥材2 g，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按照“化濕止咳湯制備工藝”制備缺白術的“陰性對照溶液”，按照“供試品溶液方法”制備，即得。照《中國藥典》2015年版第四部薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取供試品溶液、缺白術陰性溶液各10 μL、對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(2∶1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點如圖A所示。

1、2和3：20200401、20200402、20200403

2.2.2 炙甘草的鑒別 取炙甘草對照藥材2 g，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對照藥材溶液；按照“化濕止咳湯制備工藝”制備缺炙甘草的“陰性對照溶液”，按照“供試品溶液方法”制備，照《中國藥典》2015年版第四部薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取白術鑒別項下供試品10 μL、對照藥材溶液及缺炙甘草陰性溶液各3 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(15∶1:1∶2)為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外燈下(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖B所示。

2.3 指標成分含量測定及指紋圖譜建立

2.3.1 對照品溶液 精密稱定甘草苷對照品0.0055 g，置5 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液制成每1 mL含甘草苷1.1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取樣品溶液6 mL，蒸干，殘渣置5 mL容量瓶中，加70%乙醇超聲處理10 min，定容至5 mL，作為供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGⅢ(4.6 mml.D×250 mm，5 μm)流動相：1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度進行洗脫：0～10 min，10%～35%(B)；10～20 min，35%～45%(B)；20～28 min，45%～37%(B)；28～35 min，45%～37%(B)；35～40 min，37%～50%(B)流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：269 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL。

2.3.4 線性關系的考察 精密量取“2.3.1”項下甘草苷對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1 mL分別置于5 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，照“2.3.3”項下色譜條件進行，測定甘草苷含量，以甘草苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y=709430X-1986.4，r=0.999，表明化濕止咳湯在0.022～0.132 mg/mL內線性良好。

2.3.5 精密度試驗 取同一批化濕止咳湯供試品溶液(20200401)，按“2.3.3”項下色譜條件連續進樣6次，測定并計算甘草苷峰面積RSD=1.46%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取同一批供試品溶液(20200401)，按“2.3.3”項下色譜條件連續試驗6次，甘草苷平均含量：0.053 mg/mL，RSD= 2.03%，表明該方法重現性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取同一批供試品溶液(20200401)，于制備后的0、4、8、10、12、24 h，按“2.3.3” 項下色譜條件進行試驗，測定甘草苷峰面積，結果色譜峰RSD為1.96%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量化濕止咳湯(0.045 mg/mL)9份(批號： 20200401)，分成3組，每組3 mL，以供試品溶液中甘草苷含量的80%、100%、120%為梯度，加入對照品溶液適量，照“2.3.2”項下同法制備，再按“2.3.3”項下依法測定，計算回收率。見表1。

表1 甘草苷加樣回率試驗結果

3 化濕止咳湯含量測定

取3批制備樣品(20200401、20200402、20200403)，按照“2.3.2”項下同法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項下依法測定甘草苷含量，結果見表2，圖譜如圖2a所示。

表2 三批化濕止咳湯含量測定

4 陰性溶液的制備

按照“1.3”項下制備缺甘草化濕止咳湯湯劑，再按照“2.3.2”項下同法制備及“2.3.3”項下依法測定，缺甘草苷如圖2b所示，甘草苷對照品圖譜如圖2c所示。

a

5 指紋圖譜的建立

按照“2.3.2”項下同法制備供試品，再按“2.3.3”項下色譜條件，依次進樣測定化濕止咳湯劑樣品溶液 (S1～S15)， 記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相識度評價系統》(2012.130723版本)，對15批次化濕止咳湯劑的實驗結果進行評價。圖3為化濕止咳湯生成的圖譜。根據軟件匹配確定21個共有峰，15批次化濕止咳湯劑生成的對照指紋圖譜的相識度均大于0.91，以保留時間為指標，與對照品色譜圖相比，可得出9A峰為甘草苷，如圖3所示。

圖3 十五批化濕止咳湯HPLC圖

6 討論

中藥湯劑是最古老、最基本的劑型，受廣大患者好評。但是，中藥湯劑受多種因素如藥材基源、產地、煎煮等影響，從而影響治療效果的發揮[5]。因此，為了保證湯劑有效性、安全性，建立湯劑質量標準，有著重要的意義。在中藥質量研究中，基準物質作為標準參照的研究在中藥中較為成熟。1986年日本厚生對中藥口服制劑提出了基準物質概念，要求制定標準湯劑的化學基準和生物基準，用來與湯劑相比，從而保證質量[6]。2016年8月中國國家藥典委員會在《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要(征求意見稿)》中提出了標準湯劑的概念，還對標準湯劑進一步說明[7-8]。基于此，本研究對15批中藥制備的化濕止咳湯進行質量研究，以出膏率、pH、含量測定為指標，還采用指紋圖譜進行分析?；瘽裰箍葴饕蓮V藿香、山藥、白術、法半夏、炙甘草、炒紫蘇子組成，本研究利用傳統煎煮法得出15批中藥制備的化濕止咳湯出膏率為：15.98%～24.12%之間，平均出膏率為20.11%，15批化濕止咳湯最低出膏率與最高出膏率之間相差8.14%，對三批化濕止咳湯中甘草苷進行含量測定，結果為0.049、0.051、0.049 mg/mL，這表明出膏率、pH值、含量測定各結果之間相差不大，較為平穩，可作為化濕止咳湯的質量控制標準。

此外，還對15批化濕止咳湯進行指紋圖譜分析，從圖譜中可得出，共確定21個共有峰，通過與對照品比對，確定9A峰為甘草苷且重現好。因此，運用標準湯劑理念對復方制劑進行質量控制研究，不僅提高湯劑內在質量，而且對經典名方、協定處方制備提供理論支撐，也突出了中藥多方位、整體控制理念，為該制劑作為醫療機構制劑的研究提供實驗基礎。