山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸含量測定

李 軍 姜 華 張 寧 王 琦 陳雯雯 宋文博

河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471000

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)為山茱萸科山茱萸屬植物，為落葉喬木或灌木，集中分布于我國豫、陜、鄂、浙等省。生于海拔400～1500 m，的林緣或森林中。

山茱萸果實(shí)的果肉是一味常用中藥材，稱之為山萸肉、棗皮等，中醫(yī)臨床用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫等癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)[2-5]證實(shí)山茱萸中的成分具有神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)、抗腫瘤、抗氧化等作用。山萸肉臨床用量較大，然而在加工過程中，剩余的果核基本是遺棄處理。這種做法不僅不利于環(huán)保，同時也造成很大的浪費(fèi)。因此，對山茱萸果核的再利用，就顯得尤為重要。文獻(xiàn)檢索顯示，山茱萸果核已經(jīng)被用來制備活性炭[6]、提取栲膠[7]等，然而這些方法對山茱萸果核的利用程度較低。

為了進(jìn)一步挖掘山茱萸果核的利用價值，前期對山茱萸果核中化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中含有較多的白樺脂酸和熊果酸。白樺脂酸具有鎮(zhèn)咳祛痰、清熱利濕、消腫解毒、提高機(jī)體免疫力、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用[8]，熊果酸則具有殺蟲、消炎、防流感、抗糖尿病等功能[9]。然而，目前未見有對于山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測定的報道，這極大限制了山茱萸果核中該類成分的利用。基于此，本實(shí)驗建立同時測定山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸的方法，并采用該方法測定多個產(chǎn)地山茱萸果核的果殼果仁中白樺脂酸和熊果酸的含量。

1 材料

1.1 材料與試劑 白樺脂酸和熊果酸(購自上海源葉生物科技公司)；山茱萸果核(南陽西峽，洛陽嵩縣的車村、舊縣、紙坊，洛陽欒川的三川、冷水、叫河)，經(jīng)河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院路西明教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)成熟果實(shí)的果核；甲醇(DIKMA公司，色譜純)，重蒸水自制，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Shimazu LC-15C高效液相色譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(FA2004B型，上海佑科儀器儀表有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG101-3A型，鞏義予華儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-磷酸(80∶20∶0.08)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10.0 μL。在此色譜條件下，白樺脂酸和熊果酸分離度良好。

1.白樺酯酸；2.熊果酸

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的白樺脂酸和熊果酸對照品適量，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得白樺脂酸濃度為 0.21 g·L-1和熊果酸濃度為0.20 g·L-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取大小均勻的山茱萸果核適量，分離出果殼和果仁，粉碎，分別精密稱取0.5 g，置于不同的容量瓶中，加甲醇10 mL，精密稱重，然后超聲提取0.5 h，用甲醇補(bǔ)足至原重，混合均勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取取濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取白樺脂酸和熊果酸的對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL注入液相色譜儀，依“2.1”項下色譜條件記錄峰面積。以峰面積(Y×10-5)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得白樺脂酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=3.6246X-0.009(r=0.999 8)；Y=6.0447X-0.0723(r=0.999 8)。白樺脂酸和熊果酸的線性范圍分別為：0.42～4.2 μg,0.4～4.0 μg。

2.5 精密度考察 取南陽西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次10.0 μL，測定峰面積。結(jié)果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、0.7%和1.8%、2.1%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取南陽西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、10、12 h 進(jìn)樣，每次10.0 μL，測定峰面積。結(jié)果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.0%和0.8%、1.3%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性考察 取南陽西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末5 份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10.0 μL 進(jìn)樣，測定峰面積并計算含量。結(jié)果果殼中白樺脂酸和熊果酸含量的含量分別為4.29 mg·g-1、1.14 mg·g-1，RSD 值分別為0.7%、2.2%；果仁中白樺脂酸和熊果酸含量分別為3.80 mg·g-1、5.61 mg·g-1，RSD 值分別為2.0%，1.4%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率考察 精密稱取已知含量的南陽西峽產(chǎn)山茱萸果核的果殼和果核粉末各9 份，每份0.25 g，各分成3 組，每組3 份，以白樺脂酸和熊果酸含量的80%、100%、120%為梯度，分別精密加入各對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法操作，并進(jìn)樣。計算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地的山茱萸果核，按照2.2.3項下的方法制備供試品溶液，并依法測定，計算樣品中白樺酯酸和熊果酸的含量，結(jié)果見表2。可見，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量范圍為3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為0.87～1.72 mg·g-1。山茱萸果仁中白樺脂酸的含量范圍為3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為4.88～7.46 mg·g-1。

表2 不同產(chǎn)地山茱萸果核中白樺酯酸和熊果酸含量分布 (mg·g-1

3 討論

白樺脂酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)中均含有一個羧基，呈弱酸性，在中性的流動相中可發(fā)生電離，在色譜柱分離過程中形成拖尾峰，影響分離效果，而在流動相中加酸是抑制酸性成分電離的有效方法[10]。本實(shí)驗中分別嘗試了磷酸和冰醋酸來調(diào)整流動相的酸性，結(jié)果表明磷酸的效果較好，而冰醋酸的效果較差。至于磷酸的加入量，從0.01%開始逐漸增加，發(fā)現(xiàn)隨著流動相中磷酸含量的逐漸增加，白樺脂酸和熊果酸的峰形逐漸改善，其中白樺脂酸的效果尤為明顯。當(dāng)磷酸的含量增加到0.08%的比例時，白樺脂酸和熊果酸基本呈正態(tài)峰，且分離度良好，因此確定流動相中磷酸的加入量為0.08%。

將白樺脂酸和熊果酸在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果顯示，該二成分均沒有最大吸收峰，在200～220 nm之間存在末端吸收。因此，將檢測波長確定在210 nm。

表2中測定的結(jié)果顯示，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量偏高，而在果仁中熊果酸的含量偏高。果殼樣品中白樺脂酸含量最高的是欒川叫河樣品，最低的為欒川三川的樣品。在山茱萸的果仁中，熊果酸的含量最高的是欒川三川和嵩縣車村樣品，最低的是嵩縣舊縣的樣品。

本實(shí)驗建立的山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測定方法穩(wěn)定、可靠，為山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸的利用奠定基礎(chǔ)。