甘藍型油菜CBF基因家族的鑒定和表達分析

解 盼 劉 蔚 康 郁 華 瑋 錢論文,2,3 官春云,2,3,* 何 昕,2,3,*

1 湖南農業大學南方糧油作物協同創新中心, 湖南長沙 410128; 2湖南農業大學油料作物研究所, 湖南長沙 410128; 3國家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南長沙 410128; 4 湖南農業大學風景園林與藝術設計學院, 湖南長沙 410128

兩熟制、三熟制是我國南方地區推廣的主要種植模式[1], 為適應南方地區“稻–稻–油”輪作生產模式的變化趨勢, 需要種植早熟、特早熟油菜品種。但大量的研究和生產實踐表明, 油菜早熟性與抗逆性和豐產性之間始終存在著較大的矛盾, 早熟與低產、抗性差之間存在著連鎖關系[2]。早熟品種生育進程快, 現蕾、抽薹、開花都較早, 抗凍性差并且花期耐春寒能力較弱, 一旦遭遇冰凍或持續的低溫陰雨天氣, 產量損失嚴重[3]。如2008年1月, 我國遭受了嚴重的低溫冰雪災害, 對冬油菜生產帶來了嚴重的影響, 受災面積約占全國冬油菜面積77.8%, 產量損失10.88%。在受災區隨機抽樣調查發現, 受凍害影響較嚴重的品種主要為未經當地審定的早熟品種,而經過正規審定的油菜品種的受災程度較輕[4]。此外, 2010年春季“倒春寒”引起的持續低溫陰雨天氣給我國長江中下游油菜生產帶來嚴重影響, 平均減產10%~20%, 部分地區減產高達30%[5]。因此, 需要我們加強對耐寒、抗凍性強的早熟油菜品種選育研究。

低溫作為世界最為嚴重的自然災害之一, 影響植物的生長發育以及地理分布, 嚴重時甚至會造成植物死亡。目前, 低溫信號途徑研究比較清楚的是ICE1(inducer ofCBFexpression 1)–CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)–COR(cold responsive)信號途徑。研究表明,ICE1通過特異性結合CBF3啟動子上的MYC結合位點(CANNTG), 正調控CBF3基因的表達[6]。CBF轉錄因子中的AP2 domain可直接與冷調節COR基因啟動子中的CRT/DRE順式元件結合, 進而誘導COR基因的表達。在擬南芥中,CBF1/2/3串聯排列在第4條染色體上, 受冷誘導表達[7-10]。而CBF4不受冷誘導, 但在擬南芥中過表達CBF4可增強植物的抗凍性和耐旱性[11]。在擬南芥植株上過表達CBF1/2/3均明顯增強其抗凍性[8-9,12]。與野生型相比,敲除CBF1和CBF3基因擬南芥植株抗凍性降低約60%[13]。CBF1/2/3三突變體在非冷馴化時沒有或具有輕微凍敏感表型, 而在冷馴化后表現出強烈的凍敏感表型[14-16]。通過對CBF1/2/3三突變體進行RNA-seq分析發現,CBFs突變影響了全轉錄組10%~20%的COR基因表達[15]。大量研究證明, CBF基因在植物抗寒方面是一個保守的信號路徑。抗冷相關基因(CBF4、COR6、COR15和COR25)在抗凍性強的甘藍型油菜1801中的表達量顯著高于在抗凍性弱的C20中的[17]。Maryam等[18]在葡萄中發現4個受冷脅迫誘導表達的CBF基因, 這些CBF在冷處理后幾分鐘開始表達, 其中CBF2持續表達幾個小時,CBF4持續表達到第10天。

研究人員開始利用CBF基因改良作物的抗寒、抗凍性。在冷脅迫下, 超表達擬南芥CBF3基因可以增加木薯、煙草、水稻、油菜和地被石竹中脯氨酸的積累, 減少丙二醛的產生以及電解質外滲, 從而增強它們的抗寒性[19-22]。此外,OsCBF基因轉入水稻后, 脯氨酸及可溶性糖的含量明顯提高, 使得水稻的抗寒性、抗旱性和抗鹽性都有所提高[23]。但是有研究發現, 超表達甘藍型油菜BnCBF5和BnCBF17可以提高植株抗凍性, 但會嚴重抑制植株的生長發育,并推遲開花時間[24]。

為充分挖掘CBF基因, 利用CBF基因解決甘藍型油菜早熟品種與抗凍性之間的矛盾, 本研究對擬南芥、甘藍、白菜以及甘藍型油菜的CBF家族進行系統地比較分析, 鑒定甘藍型油菜、白菜和甘藍CBF基因, 并對這些CBF成員的基因結構、分子特性、基因染色體分布、系統進化樹、組織表達、不同逆境、不同激素以及不同低溫脅迫處理下的表達模式進行比較分析, 篩選候選抗凍基因, 以期為進一步了解甘藍型油菜CBF家族基因的生物學功能及其對低溫尤其是凍害響應奠定基礎, 同時為CBF家族基因在其他物種中的生物信息學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將甘藍型油菜半冬性品種中雙11號(Zhongshuang 11, ZS11)的種子在濾紙上發芽, 移栽到裝有土壤或蛭石的花盆中, 在生長室內生長6周。生長室中條件設置如下: 22℃ 14 h光照/20℃10 h黑暗, 相對濕度60%。在8:00使用100 μmol L-1脫落酸(abscisic acid, ABA)、100 μmol L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、1 mmol L-1水楊酸(salicylic acid, SA)和10 μg mL-1乙烯利(ethephon, ETH)溶液噴灑葉片進行激素處理, 并在處理后的3、6和12 h時間點采集葉片樣品。高溫脅迫和低溫脅迫, 在8:00—20:00期間, 生長室分別設置為40℃和4℃, 相對濕度60%。在脅迫處理的3、h和12 h時間點采集葉片樣品。鹽脅迫和PEG脅迫處理, 分別在8:00—20:00期間用200 mmol L-1NaCl或20%聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液灌溉幼苗, 并在處理期間的3、6和12 h時間點采集根系樣本。對照幼苗用去離子水處理, 每個處理重復3次, 每個處理用3~4株幼苗。采集的葉和根樣本立即在液氮中冷凍, 然后在-80℃下保存以提取RNA[24]。

在光照培養箱中培育2個早熟的半冬性油菜品種(HX17和HX58)的幼苗, 生長室條件設置如下: 20℃14 h光照(6:00—20:00)/16℃10 h黑暗(20:00—6:00),相對濕度60%, 培養4周; 冷馴化冷害與凍害處理:在4℃條件下處理14 d后, 分別放入4℃和-4℃處理12 h; 非冷馴化冷害與凍害處理: 20℃ 14 h光照(6:00—20:00)/16℃10 h黑暗(20:00—6:00)處理6周后, 分別放入4℃和-4℃處理12 h; 其中, 4℃冷害/-4℃凍害處理12 h的時段為20:00—8:00 (黑暗10 h/光照2 h), 在處理后的上午8:00收集從頂部往下數的第3片葉子并立即保存在-80℃, 直到提取RNA[25]。

1.2 白菜、甘藍及甘藍型油菜CBF基因的篩選鑒定

從Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)數據庫中獲取擬南芥、白菜(Brassica rapa)、甘藍(Brassica oleracea)、甘藍型油菜(Brassica napus)的CBF基因全長DNA序列、CDS序列、蛋白的氨基酸序列及相關信息。首先在Ensembl Plants中下載擬南芥CBF基因的核酸序列和蛋白的氨基酸序列, 利用BLASTP比對甘藍型油菜、白菜和甘藍基因組, 以E<10–5為閾值分別篩選出對應的CBF候選同源基因,并利用BLASTP比對NCBI非冗余數據庫鑒定候選基因是否為CBF同源基因。

1.3 生物信息學分析

利用DNAMan6.0軟件對擬南芥、白菜、甘藍和甘藍型油菜CBF蛋白序列比對分析, 并使用MEGA7中的Neighbour-Joining (NJ)系統發育方法構建系統發育樹[26]。利用MEME (http://MEME.nbcr.net/ MEME/cgi-bin/MEME.cgi)對擬南芥、白菜、甘藍和甘藍型油菜CBF進行保守結構域分析。使用Compute-pI/Mw工具(http://web.expasy.org/ComputepI/)和ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/)預測分子量(molecular weight, MW)、等電點(Isoelectric point prediction, pI)和亞細胞定位。使用TBtools軟件(TBtools_v.6695)展示基因結構、具體的染色體分布情況。參考以往的研究報道[27], 在100 kb基因組范圍內排列有2個及以上基因, 我們將其定義為串聯重復基因。

1.4 表達熱圖分析

參考He等[24-25]以及本課題組尚未公開的數據進行熱圖分析, 采用TBtools軟件(TBtools.v.6695)作圖。

1.5 BnaCBF基因表達情況檢測

參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取植物總RNA, 用反轉錄試劑盒合成cDNA。根據甘藍型油菜BnaCBF參考基因序列, 通過Primer premier 6.0軟件設計qRT-PCR特異性引物, 引物序列見表1。采用Bio-Rad CFX96-M實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad, 美國)檢測目標基因的表達。參照熒光定量試劑盒說明書配置20 μL的反應體系, 含2×Trans start, Tip Green qPCR Super Mix 10 μL、cDNA模板2 μL、正反向引物(0.2 μmol L-1)各0.5 μL、去離子水7 μL。qRT-PCR反應程序為95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 45 s, 40個循環。選用BnaActin作為內參基因, 采用2-ΔΔCt方法分析基因表達變化情況。

表1 本研究所用qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR used in this study

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜、白菜和甘藍CBF基因鑒定

利 用4個AtCBF (At4g25490、At4g25470、At4g25480和AT5G51990)核苷酸和氨基酸序列分別在甘藍型油菜、白菜和甘藍的基因組數據庫中進行同源序列搜索, 并結合SMART數據庫、InterPro和NCBI數據庫中的保守域(conservative domain, CD)搜索分析, 最終獲得11個甘藍型油菜CBF基因(BnaCBF)、6個白菜CBF基因(BraCBF)、5個甘藍CBF基因(BoCBF)。其中11個甘藍型油菜CBF基因編碼區長度在576~663之間, 編碼189~220個氨基酸, 預測等電點(Isoelectric point prediction, pI)在4.58~6.14之間, 為酸性蛋白, 分子量在20.57~24.56 kD之間。亞細胞定位預測表明, 這11個甘藍型油菜CBF基因在細胞核中, 具體信息詳見表2。

2.2 擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜CBF基因的序列比對分析

將鑒定得到的CBF家族蛋白的保守結構域通過DNAMAN軟件比對(圖1)發現, 蛋白序列保守性較高, 甘藍型油菜、白菜、甘藍及擬南芥的26個CBF序列比對一致性為61.08%, 這些基因都具有相同的保守序列AP2 domain (圖1紅色框出部分)。與其他成員相比,BnaCnng49280D、Bra010463和BnaA08g 30930D3個基因在AP2domain的前半部分有27個氨基酸序列缺失。

2.3 擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜的CBF基因進化樹分析

為揭示甘藍型油菜及其二倍體祖先種之間CBF家族基因的進化關系, 本研究利用MEGA7.0軟件對擬南芥、白菜、甘藍和甘藍型油菜的CBF蛋白序列進行系統發育分析, 構建系統進化樹(圖2-A)。26個CBF蛋白被分為2個亞組, 與前人研究結果一致。亞組I中含有包括擬南芥AtCBF1/2/3在內的21個基因,其中, 5個白菜CBF基因、4個甘藍CBF基因以及9個甘藍型油菜CBF基因, 它們與擬南芥AtCBF1/2/3基因比對一致性分別為79.77%、68.38%和72.98%; 亞組II中含有包括擬南芥AtCBF4在內的5個基因, 其中2個來自甘藍型油菜, 白菜和甘藍各1個, 它們與擬南芥CBF4比對一致性分別為91.07%、80.36%和79.91%。進一步分析發現, 除白菜基因Bra010461外,其他白菜和甘藍基因在甘藍型油菜中均存在直系同源基因; 11個甘藍型油菜CBF基因中, 除BnaA08g 30910D外, 其他10個基因都能在白菜和甘藍中找到同源基因。

2.4 基因結構分析和MEME分析

為進一步揭示甘藍型油菜、白菜和甘藍及擬南芥CBF基因家族的進化關系, 本研究對其基因結構(圖2-B)和motif進行了預測分析(圖2-C)。CBF基因具有相對保守的基因結構和蛋白功能結構域,CBFs內含子的數目在0~2之間, 亞組I中, 有7個CBF基因有內含子, 其中白菜中2個CBF基因、甘藍型油菜1個CBF基因有1個內含子和2個外顯子, 甘藍型油菜中4個CBF基因有2個內含子和3個外顯子, 其他14個CBF基因只有1個外顯子沒有內含子, 與擬南芥AtCBF1/2/3基因結構一致, 進化樹關系也更近; 亞組II中5個CBF基因沒有內含子, 基因結構一致, 具有保守性。進一步分析發現, 亞組I中白菜中Bra010460、Bra010463含有1個內含子, 甘藍型油菜中與這2個基因進化同源關系BnaA08g30950D和BnaA08g30930D含有2個內含子, 因此推斷這4個基因在進化過程中可能發生了變異; 另一方面, 甘藍型油菜中BnaUnng01150D有1個內含子,BnaCnng49280D有2個內含子, 而它們對應的同源基因Bo8g050800和Bo8g050740沒有內含子, 推測這2個甘藍型油菜CBF基因進化過程可能發生了變異;同時我們在進化樹分析中推斷BnaA08g30910D可能是BnaA08g30950D的拷貝基因, 兩者基因結構一致。

?

Motif預測分析結果表明, Motif預測分析與進化樹比對分析結果吻合, 可明顯分為2個亞組, 2組保守基序組成高度相似。圖2-C展示了保守性較高的6條基序在26條CBF蛋白序列中的分布情況, 可見各蛋白高度保守, 但不同亞組之間蛋白序列包含的保守基序的種類和數目存在一定的差異, 2個亞組內蛋白保守基序的組成模式更為相似。26條CBF蛋白序列都含有Motif 6、Motif 1、Motif 4和Motif 3, 由此推斷這些區域可能是CBF家族蛋白共性的、保守的功能基序。進一步分析發現, 亞組I中的22個成員保守基序組成模式較為一致, 除了亞組I中BnaUnng01150D、BnaA08g30930D不含有Motif5, 其余成員保守基序組成模式與擬南芥CBF1/2/3蛋白保守基序完全一致, 均為Motif6-Motif2-Motif1-Motif4-Motif5-Motif3。亞組II中, 所有成員保守基序組成模式完全一致, 均為Motif6-Motif2-Motif1-Motif4-Motif3; 植物中的CBF家族蛋白含有1個高度保守的AP2domain, AP2domain包括Motif2-Motif1-Motif4保守基序。與亞組I相比, 亞組II少了1個保守基序Motif5,由此推測Motif5為亞組I的特征Motif。

2.5 染色體定位分析

ATCBF1/2/3基因在Chr4染色體上串聯,AtCBF4在Chr5染色體上(圖3); 6個BrCBF基因分別在A03、A08和A10染色體上分布, 其中Bra010460、Bra010461和Bra010463在A08號染色體上串聯(圖3); 6個BoCBF基因被定位在C03、C07、C08、C09染色體上, 其中Bo8g050800和Bo8g050740在C08染色體上串聯(圖3); 根據Region Comparison(http://plants.ensembl.org/)分析, 我們對每個CBF成員之間的共線性進行比較分析發現,BnaA08g 30950D和BnaA03g13620D與AtCBF1同 源,BnaUnng01150D、BnaA08g30910D、BnaCnng492 80D、BnaC03g71900D、BnaAnng-34260D和BnaC07g 39680D與AtCBF2同源,BnaA08g30930D與AtCBF3同源,BnaA10g07630D和BnaC09g28190D與AtCBF4同源,這些BnaCBFs基因被定位到19條染色體中的9條上(圖3), 其中BnaA08g30910D、BnaA08g30930D和BnaA08g30950D在染色體A08 random上串聯重復。

2.6 甘藍型油菜BnaCBF基因在不同組織中的表達模式分析

利用本課題組前期完成的中雙11材料的轉錄組數據, 分析了甘藍型油菜CBF基因家族在各組織器官中表達情況, 以及在不同非生物脅迫和激素處理下的表達情況。在正常情況下, 亞組I中9個BnaCBF成 員 可 分 為Ia類 和Ib類, 其 中Ia類5個CBF成 員(BnaA08g30950D、BnaUnng01150D、BnaA08g309 10D、BnaA08g30930D和BnaCnng49280D)在各個組織器官中表達量均較低或者不表達; Ib類4個成員(BnaA03g13620D、BnaC03g71900D、BnaAnng34260D和BnaC07g39680D)分別在莖、葉片和雌蕊中表達,其中BnaAnng34260D在雌蕊中表達量較高; 亞組II中 的2個CBF4成 員(BnaA10g07630D和BnaC 09g28190D)在根、葉片、花萼和雌蕊中均有表達, 并且在根部表達量明顯高于其他組織器官(圖4)。

2.7 甘藍型油菜BnaCBF基因在不同非生物逆境和不同激素處理表達模式分析

所有BnaCBF在逆境處理下均存在不同程度的表達。在低溫下, Ia類5個基因(BnaA08g30950D、BnaUnng01150D、BnaA08g30910D、BnaA08g30930D和BnaCnng49280D)對冷脅迫迅速響應表達, 并在3 h后表達量顯著下降, 意味著這5個基因是早期冷誘導表達基因。Ib類4個基因(BnaA03g13620D、BnaC03g71900D、BnaAnng34260D和BnaC07g39680D)對冷脅迫響應迅速且持續時間長, 冷處理12 h仍有較高表達量; 而亞組II兩個CBF4基因(BnaA 10g07630D和BnaC09g28190D)在冷脅迫條件下表現為早期高表達, 而后降低, 6 h后恢復正常。BnaA10g07630D和BnaC09g28190D兩個基因在根中表達量明顯高于葉片, 并且參與鹽脅迫和滲透脅迫響應, 而其他9個基因在根中表達變化不大(圖5)。值得注意的是, Ib類4個CBF基因的表達表現出較明顯的生物鐘節律變化, 它們在11:00 (Leaf_3h)表達量較低, 14:00表達量較之前升高, 20:00表達量幾乎為零, 表現出明顯的晝夜節律; 亞組II中的2個CBF4基因(BnaA10g07630D和BnaC09g28190D)也呈現出明顯的晝夜節律, 不同于Ib類CBF基因, 其在11:00和14:00幾乎不表達, 但在20:00有較高的表達量。其他ABA、MeJA和ET等激素處理后表達量與對照無明顯變化。

2.8 不同低溫處理下甘藍型油菜BnaCBF基因表達模式分析

為進一步分析這些CBF成員對不同低溫的響應,本研究利用本課題組前期完成的冷馴化和非冷馴化材料中不同低溫處理的HX-17和HX-58材料的轉錄組數據, 對甘藍型油菜BnaCBF基因家族的表達情況進一步分析(圖6)。亞組I中有3個CBF基因在冷脅迫下表達較弱甚至不表達, 凍害脅迫下表達量升高;其他6個成員在4℃冷害處理和-4℃凍害脅迫下均有不同程度響應, 且-4℃凍害脅迫下表達量更高。亞組II 2個CBF4成員僅在凍害脅迫條件響應表達, 意味著甘藍型油菜中CBF基因家族對凍害響應更強烈。分析發現, 冷馴化和非冷馴化的材料對低溫脅迫和凍害脅迫的響應表達的影響無明顯差異。

2.9 BnaCBF基因相對表達量結果分析

為驗證上圖中的RNA-seq數據, 本研究從油菜CBF基因家族亞組Ia、Ib和II中挑選4個具有代表性的基因進行qRT-PCR驗證, 分別是亞組Ia類基因BnaCnng49280D, Ib類基因BnaAnng34260D以及亞組II的BnaA10g07630D和BnaC09g28190D。結果顯示, 表達情況與圖5和圖6中完全吻合, 說明表達譜數據可靠(圖7和圖8)。

3 討論

甘藍型油菜是我國最主要的栽培品種, 在湖南、湖北、江西、浙江、云南等多地大面積種植[4]。南方地區推廣的稻–稻–油輪作生產模式需要種植早熟、特早熟油菜品種, 但早熟型油菜推廣面臨抗凍性差、產量受影響等問題[2]。CBF基因家族在植物抗凍性研究中具有重要作用[28], 因此, 系統的比較分析甘藍型油菜CBF基因以及在油菜二倍體祖先中的進化關系, 對解析CBF基因調控油菜低溫及凍害脅迫反應的機制具有重要的意義。

CBF/DREB1依賴的冷信號通路在過去的20年中取得了長足的進展。從最早發現的一種對干旱、寒冷和高鹽脅迫有響應的順式作用元件C-反應/脫水響應元件(CRT/DRE)開始[29], 研究者陸續從擬南芥、油菜、小麥(Triticum aestivum)、黑麥(Secale cereale)、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)及玉米(Zea mays)等植物中分離克隆出許多CBF的ESTs序列, 發現其都具有冷誘導特性[30-32],過表達擬南芥及其他CBF基因均可以增強植物的抗凍性[12,19]。大量研究證實, 在植物中這些CBF是參與冷脅迫信號傳導, 并在不同物種間具有保守性。

本研究發現,AtCBF在甘藍型油菜、白菜和甘藍基因組都存在直系同源基因, 且這些CBF成員序列高度保守, 根據基因結構和Motif等結果分析, 推測BnaA08g30910D可能是BnaA08g30950D的拷貝復制。甘藍型油菜CBF家族蛋白的結構域保守性較高,所有成員都有且只有1個AP2 domain, 在此結構域的上下游, 各有一段保守的氨基酸序列PKKP/PKK PAGR (RAGRxxKFx ETRHP)和DSAWR[33], 該保守序列在CBF發揮其轉錄因子功能中扮演著非常重要的角色。

基因中內含子和外顯子的組成對于其進化分析研究具有非常重要的作用[34], 本研究對CBF基因家族各成員的基因結構分析推斷含有內含子的CBF基因在進化過程中可能發生了變異。Motif預測分析發現, 所有的CBF基因中Motif1、Motif3、Motif4和Motif6這4個Motif是CBF基因家族的特征性Motif。保守基序分析發現,BnaCnng49280D、BnaA08g 30930D和Bra010463三個基因缺失的27個氨基酸序列位于AP2 domain上游, 結構域分析發現該缺失部分在Motif2區段, 由此推測可能會影響它們結合靶基因啟動子中順式元件CRT/DRE的能力, 從而影響它們激活下游靶基因(如COR)的表達。染色體定位分析表明, 11個甘藍型油菜CBF基因在染色體上的分布是不均勻的, 這可能是由于在全基因組加倍過程中,一些同源基因可能發生丟失或擴張。

CBF參與多種逆境響應和植株生長發育等過程[35-36]。本研究發現, 甘藍型油菜CBF基因的表達強烈受低溫誘導, 且具有明顯的組織特異性, 由此推斷甘藍型油菜CBF基因可能在功能上產生細化。A亞基因組BnaA03g13620D、BnaAnng34260DCBF的表達量明顯高于對應的C亞基因組BnaC03g 71900D、BnaC07g39680D的表達量, 說明A、C亞基因組的基因對表達量存在明顯偏移不對稱。

Haake等[11]研究表明,CBF1/2/3(CBF1/DREB1b、CBF2/DREB1c、CBF3/DREB1a)屬于冷誘導CBF基因, 還有一個CBF基因(CBF4)不受冷誘導表達; 但過表達CBF4會增強植物的抗凍性和耐旱性的。本研究發現, 11個BnaCBF中, 與AtCBF1/2/3同源的9個基因對冷脅迫迅速響應, 并且凍害脅迫比冷脅迫響應更為強烈;AtCBF4同源的2個BnaCBF基因BnaA10g07630D和BnaC09g 28190D輕微冷脅迫響應, 但強烈響應凍害脅迫。由于前人主要以非典型的越冬植物如水稻、擬南芥、番茄等作為研究材料, 相關凍害研究開展的較少, 但由于甘藍型油菜本身是越冬性作物, 生育期通常會經歷一段較長的低溫凍害時期, 因此BnaCBFs基因在低溫時的誘導表達沒有凍害脅迫下強烈。另外, 本研究中發現, 冷馴化的凍害和非冷馴化凍害下表達差異不大, 說明BnaCBFs基因馴化和非冷馴化條件下均起作用。

4 結論

本研究鑒定出甘藍型油菜中11個CBF基因家族成員, 并將BnaCBFs分為亞組I (CBF1/2/3)和亞組II (CBF4) 2個亞組。所有甘藍型油菜CBF基因受低溫誘導表達, 其中亞組Ib的4個基因BnaA03g 13620D、BnaC03g71900D、BnaAnng34260D、BnaC07g 39680D對冷脅迫響應迅速且持續時間長, 亞組II中2個基因BnaA10g07630D和BnaC09g28190D對冷脅迫響應表達較弱, 但它們在根中表達量明顯高于葉片, 并且參與鹽脅迫和滲透脅迫響應; BnaCBF對凍害響應更強烈。本研究將為進一步了解甘藍型油菜CBF家族基因的生物學功能、低溫脅迫尤其是凍害脅迫研究及耐寒、抗凍品種培育奠定了基礎。