甘藍型油菜絲裂原活化蛋白激酶7基因(BnMAPK7)上游調控因子的鑒定

王 珍 張曉莉 孟曉靜 姚夢楠 繆文杰 袁大雙朱冬鳴 曲存民 盧 坤 李加納,* 梁 穎,*

1 西南大學農學與生物科技學院 / 油菜工程研究中心, 重慶 400715; 2 西南大學現代農業科學研究院, 重慶 400715

油菜是世界上重要的農作物之一, 在種植面積、產量、植物油供給、蛋白來源等方面位于我國油料作物之首, 在農業生產上占據著舉足輕重的地位[1]。甘藍型油菜(Brassica napus)作為我國廣泛種植的栽培種, 較白菜型油菜及芥菜型油菜, 在植株抗性及產量等方面存在明顯優勢[2]。作為一種異源四倍體植物, 其基因組相對復雜, 在馴化栽培中具有廣泛的變異, 在進化研究中也具有重要的科學價值。我國幅員遼闊、地形復雜、氣候多變、環境特殊, 生物及非生物脅迫等問題直接影響國民的增收及油料產業的發展, 包括核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、霜霉病(Peronospora parasitica)、干旱、漬害和澇害等[3-4]。近年來, 對抗逆基因進行功能研究、并對抗性表現良好的基因加以利用, 已經成為培育油菜抗性新品種的一條新途徑。

為了應對逆境, 植物進化出一些特殊機制, 通過調控酶活性、轉錄、翻譯及修飾等, 感知并適應生理、生長及發育。其中, 通過信號級聯中的蛋白激酶進行蛋白磷酸化調控是所有生物體中最常見的一種翻譯后修飾[5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases, MAPKs)級聯是進化上非常保守的信號通路, 是多種信號跨膜傳遞的交匯點或共同通路[6-7]。植物感受到外源刺激信號后, MAPKs級聯通過磷酸化過程激活信號并將其轉入胞內, 活化細胞骨架蛋白、轉錄因子、磷脂酶、微管相關蛋白等[8-10], 進而調控植物的生長發育以及生物和非生物脅迫應答過程, 包括病原菌侵害、冷、熱、活性氧、紫外線、干旱等[11-15]。常見的MAPKs級聯包含由不同基因家族編碼的3種激酶, 從上至下分別由MAPKKKs (MAPKs kinases kinases)、MKKs(MAPKs kinases)和MAPKs組 成[6]。活 化 的MAPKKKs首先磷酸化MKKs的Ser/Thr殘基, 隨后活化的MKKs對下游MAPKs保守結構域T-X-Y進行雙重磷酸化, 觸發MAPKs對下游底物的活化[16]。擬南芥中大約有20個MAPKs, 分為A~D四個亞族,其中C亞族共有4個基因:AtMAPK1、AtMAPK2、AtMAPK7和AtMAPK14[13,17]。研究報道, 在擬南芥中,AtMAPK7受到H2O2和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的誘導與激活, 參與調控下游病原菌防御相關基因的表達[18]。AtMAPKKK17/18-AtMKK3-AtMAPK7級聯被報道與脫落酸(abscisic acid, ABA)信號途徑交聯, 參與ABA的應答過程[19]。與擬南芥AtMAPK7的功能相似, Zong等[20]在玉米中發現,ZmMAPK7基因也受到ABA與H2O2的誘導, 并正向調控ABA和活性氧(reactive oxygen species, ROS)介導的滲透脅迫應答。此外, 棉花GhMAPK7基因響應H2O2、鹽、損傷、水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的非生物脅迫應答和立枯病(Rhizoctonia solani)、炭疽病(Colletotrichum gossypii)、枯萎病(Fusarium oxysporumf. sp.vasinfectum)的防御應答過程[21]。GhMKK3-GhMAPK7級聯途徑被報道受到ABA及干旱誘導, 并通過調控棉花根系的生長和失水率在抗旱性中發揮重要作用[22]。本課題組前期克隆了甘藍型油菜BnMAPK7基因,發現其受到ABA、H2O2、MeJA、SA、熱、損傷及核盤菌的誘導[23]。這些結果表明,MAPK7基因在植物的生物和非生物脅迫過程中具有重要的作用, 同時, 以MAPK7為底物的MAPKs級聯通過蛋白磷酸化修飾參與調控脅迫應答。然而, 上游因子是如何調控植物MAPK7基因轉錄表達的分子網絡尚未見報道。

本試驗參考擬南芥和甘藍型油菜數據庫, 克隆了BnMAPK7(BnaA09g09520D)啟動子序列, 經過分析ProBnMAPK7的順式作用元件及MAPK7的表達模式, 通過構建BnMAPK7啟動子核心區段的酵母單雜交體系篩選與其相互作用的上游調控因子等深入探索, 解析了BnMAPK7可能參與的生物學過程及其潛在的上游調控因子, 旨在為逐步深入完善甘藍型油菜BnMAPK7的基因功能提供新的內容, 并為MAPKs級聯途徑的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘藍型油菜中油821單倍體加倍(doubled haploid, DH)系與本氏煙草(Nicotiana benthamiana)由重慶市油菜工程技術研究中心提供, 并種植于人工氣候光照培養箱, 生長條件為16 h光照(25℃)/8 h黑暗(16℃), 濕度50%。利用甘藍型油菜中油821克隆BnMAPK7基因的啟動子, 本氏煙草用于啟動子的核心區段篩選。大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101及pCambia1305.1-GUS表達載體均由本研究室保存,用于啟動子的克隆、轉化及瞬時表達研究。釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) Y1H gold、pAbAi表達載體及pGADT7-Rec-p53對照載體購自Takara公司, 用于啟動子及其上游的功能研究。植物DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司, KOD neo plus高保真酶購自Toyobo公司, LB/YEB培養基所用試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 抗生素AbA (Aureobasidin A)、酵母培養及轉化試劑購自Clontech公司, 引物合成和測序由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成。

1.2 啟動子的克隆及核心元件分析

參照植物DNA提取試劑盒說明書, 提取苗期(20~25 d)甘藍型油菜植株幼嫩葉片基因組DNA。利用分光光度計NanoDrop 2000c (Thermo Scientific)檢測DNA濃度及純度, 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。根據TAIR10數據庫(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)和Genoscope數 據 庫(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)查找獲得AtMAPK7(AT2G18170)基因對應的甘藍型油菜BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因的上游啟動子序列,利用Primer3web (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)[24]設計引物(表1)。以基因組DNA為模板, 使用ProBn MAPK7-PA-F+ProBnMAPK7-PA-R引物進行擴增,加dA連接至pGEM-T easy載體, 轉化E. coliDH5α感受態細胞, PCR鑒定后進行測序, 獲得目的啟動子序列。利用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.ht ml)[25]在線分析啟動子的順式作用元件。

1.3 MAPK7基因在擬南芥及甘藍型油菜中的RNA-seq分析

利用Arabidopsis RNA-seq Database (http://ipf.sustech.edu.cn/pub/athrna/)[26]分析AtMAPK7(At2g 18170)在擬南芥不同組織器官、發育期、生物及非生物脅迫過程中的基因表達水平。“All Tissue”全選,“Biotic Stress”設置為Virus、Fungal、Bacterial、Metazoan plant exposure, “Abiotic Stress”設 置 為Ecological environment、Chemical exposure、Physical plant exposure, “FPKM”參數默認設置。此外, 根據本研究室前期對甘藍型油菜中雙11植株不同組織器官及不同時期的RNA-seq (PRJNA358784)[27]結果,提取BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因的FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million)值,用以分析時空特異性表達模式。另外, 根據我們前期對甘藍型油菜中油821植株的冷、干旱、熱以及弱光脅迫處理后的RNA-seq (PRJNA680826)數據,以正常環境下生長的植株為對照組, 提取BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因的FPKM值, 用以分析4種逆境脅迫下BnMAPK7的響應模式。

1.4 啟動子表達載體的構建及本氏煙草的遺傳轉化

1.4.1 植物表達載體pCambia1305.1-ProBnMAPK7-GUS的構建 利用限制性內切酶NcoI和SalI對pGEM-T-ProBnMAPK7 重組載體以及pCambia1305.1-GUS空白表達載體分別進行雙酶切,并將回收純化的ProBnMAPK7片段連接至pCambia1305.1-GUS骨架以替換35S啟動子, 轉化E. coliDH5α感受態細胞, 分別采用p1305.1-F+p1305.1-R、GUS-F+GUS-R以及Hyg-F+Hyg-R (引物序列見表1) 3對引物進行PCR鑒定, 測序后獲得陽性pCambia1305.1-ProBnMAPK7-GUS重組質粒。將驗證后的重組質粒轉化至農桿菌GV3101菌株中,同時使用利福平Rif、鏈霉素Str及卡那霉素Kan三種抗生素進行篩選, 并采用p1305.1-F+p1305.1-R、GUS-F+GUS-R和Hyg-F+Hyg-R三對引物檢測重組菌株的完整性, 陽性菌株保存備用。

1.4.2 表達載體轉化本氏煙草 參照本研究室前述方法[28]收集菌體, GV3101-pCambia1305.1-ProBnMAPK7-GUS陽性菌株先以1∶1000 (保存菌液∶液體培養基)比例進行活化培養1~2 d, 再按照1∶100 (活化菌液∶液體培養基)比例擴大培養至OD600為0.8~1.0。將菌液收集至離心管中, 室溫條件下6000×g離心5 min, 收集菌體。根據靳義榮等[29]方法改進制備重懸菌液, 加入適量的Injection buffer(10 mmol L-1MgCl2, 10 mmol L-1MES, 200 μmol L-1AS)將菌體重懸至OD600為0.4~0.5, 28℃避光靜置3~6 h以提高重懸菌液的活性。根據Leuzinger等[30]方法改進, 將重懸菌液注射至1月齡的本氏煙草幼嫩葉片, 注射后的植株置于25℃黑暗培養36~48 h, 用于ProBnMAPK7的GUS組織化學染色及信號觀察。

1.4.3 啟動子的核心區段篩選 根據預測的核心元件位置, 首先將全長啟動子截短為左右2個片段,命名為ProBnMAPK7-lPB和ProBnMAPK7-rPB。分別采用特異引物(表1)進行PCR擴增, 加dA連接至pGEM-T easy載體, 菌液PCR及測序檢測后, 使用限制性內切酶NcoI和SalI將截短后的片段分別連接至空白表達載體pCambia1305.1-GUS骨架。采用與pCambia1305.1-ProBnMAPK7-GUS重組菌株相同的引物進行PCR檢測, 測序后的陽性重組表達質粒轉化至農桿菌GV3101感受態細胞。重組菌株同樣用于本氏煙草的瞬時遺傳轉化及其GUS組織化學染色及信號觀察。根據GUS結果, 選擇ProBnMAPK7-lPB和ProBnMAPK7-rPB中具有GUS信號或信號更強的一段序列, 再次截短為2個片段并構建重組表達載體, 瞬時轉化本氏煙草后檢測其GUS表達信號, 直至篩選到<250 bp大小的核心區段。ProBnMAPK7的核心區段用于酵母單雜交的Bait毒性和自激活活性檢測以及文庫篩選。

1.5 GUS組織化學染色

分別對全長啟動子及逐步截短的不同長度的啟動子片段進行GUS信號檢測, 以確定ProBnMAPK7的核心區段。陽性對照為空白表達載體pCambia1305.1-GUS農桿菌菌株, 陰性對照為空Injection buffer。將暗培養36~48 h的本氏煙草葉片浸沒于GUS Staining buffer (50 mmol L-1NaH2PO4,50 mmol L-1Na2HPO4, 10 mmol L-1Na2EDTA, 0.5 mmol L-1K3[Fe(CN)6], 0.5 mol L-1K4[Fe(CN)6],0.1% Triton-X100, 0.5 mg mL-1X-Gluc, pH 7.2)中,并將其置于37℃黑暗條件下反應8 h以上。反應結束后, 棄GUS Staining buffer, 使用蒸餾水清洗反應后的葉片3次以去除殘留的GUS Staining buffer。而后, 向葉片中加入95%乙醇初步脫色10 min, 再使用75%乙醇進行脫色, 直至脫色完全。在體視顯微鏡(Olympus DP80)下觀察GUS信號并照相。

1.6 ProBnMAPK7的酵母單雜交文庫篩選

1.6.1 pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3的Bait載體及菌株的構建 委托深圳華大基因股份有限公司合成ProBnMAPK7-rPE核心區段的3拷貝串聯重復序列ProBnMAPK7-rPE×3。分別采用限制性內切酶Hind III和Sal I對T-ProBnMAPK7-rPE×3以及pAbAi質粒進行雙酶切, 將ProBnMAPK7-rPE×3連接至pAbAi骨架, 轉化E. coliDH5α感受態細胞。采用pAbAi-F+pAbAi-R引物對pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3 (Bait)菌液進行PCR檢測及測序(引物序列見表1)。使用BstBI線性化Bait及陽性對照pAbAi- p53質粒, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 分別回收線性化的Bait及pAbAi-p53骨架。參照Clontech Yeastmaker Yeast Transformation System說明, 制備Y1H gold感受態細胞, 并將線性化的Bait及pAbAi-p53質粒分別轉化至Y1H gold細胞, 涂布于SD/-Ura培養基, 置于30℃恒溫培養箱內倒置培養1~3 d。分別挑取Y1H-Bait及Y1H-p53單克隆, 加入適量0.9% NaCl稀釋菌體, 置于98℃加熱10 min后, 采用KOD neo plus高保真酶進行PCR檢測, 引物為Bait-F+Bait-R (表1), 陽性菌落保存備用。

表1 本研究所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.6.2 Y1H-pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3 (Y1H-Bait)的AbA背景檢測 首先取適量Y1H gold、Y1H-Bait及Y1H-p53菌液分別涂布至不含AbA和100 ng mL-1AbA的SD/–Ura平板上, 30℃倒置培養3~5 d, 觀察比較菌落的生長情況, 以測試抗生素AbA的有效性。隨后, 沾取適量Y1H gold、陽性Y1H-Bait和Y1H-p53菌落至100 μL 0.9% NaCl溶液重懸, 將重懸菌液分別按照10-1、10-2及10-33個梯度進行稀釋。各取10 μL稀釋菌液置于含有不同濃度AbA的SD/–Ura平板上, AbA濃度分別為0、100、200、300、500 ng mL-1, 30℃倒置培養3~5 d后, 觀察比較菌落的生長情況, 以確定能夠完全抑制Y1H-Bait自激活的最低AbA濃度。陽性對照為Y1H-p53, 陰性對照為Y1H gold空白菌株。

1.6.3 pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3的酵母單雜交文庫的篩選及測序 采用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System, 參照Yeastmaker Transformation System 2操作手冊, 制備Y1H-p53及Y1H-Bait的酵母感受態細胞。按照本實驗室前期酵母雙雜交的小量轉化法[28]將pGADT7-Rec-p53質粒轉化至Y1H-p53感受態細胞, 取100~200 μL轉化液涂布于80 mm SD/-Leu/AbA500平板。文庫篩選則采用本研究室前期制備的甘藍型油菜苗期(3~4片真葉)的根系、莖(莖尖2~3 cm)和葉片(芯芽葉及幼葉)的混合cDNA酵母文庫[28], 按照文庫量轉化法進行Y1H-Bait的酵母單雜交文庫篩選。將Carrier DNA置于100℃加熱5 min, 立即取出置于冰上2 min使其變性。向15 mL無菌螺口離心管內加入20 μL變性Carrier DNA與10 μg文庫質粒均勻混合后, 加入600 μL Y1H-Bait酵母感受態細胞, 溫和混勻; 加入2.5 mL PEG/LiAc buffer (2 mL 40% PEG-3350, 250 μL 10×TE buffer, 250 μL 1 mol L-1LiAc), 輕柔渦旋混勻, 30℃孵育45 min, 每間隔15 min溫和混勻一次。隨后, 加入160 μL DMSO, 輕柔渦旋混勻, 42℃孵育20 min, 每間隔10 min溫和混勻一次。取出后2000×g室溫離心5 min, 槍頭吸除上清, 加入3 mL YPD Plus Medium重懸酵母菌體,置于30℃搖床復蘇90 min。取出后2000×g室溫離心5 min, 槍頭吸除上清, 加入15 mL 0.9% NaCl重懸酵母菌體, 涂布于80 mm SD/-Leu/AbA500平板, 每個平板100~200 μL, 直至所有重懸轉化液涂布完全。平板置于30℃倒置培養3~5 d后, 觀察菌落的生長狀況。將文庫篩選過程中的所有SD/-Leu/AbA500平板上的酵母菌落劃線分離純化后, 采用AD-F+AD-R引物進行PCR擴增, 并對PCR產物進行測序及序列比對分析。提取分離純化酵母中的Prey質粒, 轉化至E. coliDH5α感受態細胞擴繁質粒后, 分別在AbA濃度為500、800 ng mL-1條件下與Y1H-Bait進行點對點Y1H回轉驗證。

(續表1)

2 結果與分析

2.1 ProBnMAPK7的克隆及順式作用元件分析

以甘藍型油菜中油821基因組DNA為模板, 參考TAIR10和Genoscope數據庫設計特異引物擴增BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因上游的啟動子序列。經克隆、測序得到BnMAPK7基因起始密碼子ATG上游1612 bp長度的啟動子片段, 命名為ProBnMAPK7。其中, 腺嘌呤(A) 527個, 占32.69%;鳥嘌呤(G) 230個, 占14.27%; 胞嘧啶(C) 260個, 占16.13%; 胸腺嘧啶(T) 595個, 占36.91%。

利用PlantCARE數據庫分析ProBnMAPK7序列所含的關鍵順式作用調控DNA元件發現, 該啟動子中含有多種響應植物外在信號的順式作用元件(表2)。如光照響應元件ACE、Box 4、G-box、MRE、TCT-motif等; 感知厭氧誘導、干旱、防御及損傷的響應元件ARE、MBS、TC-rich repeats、WUN-motif等; 激素類(ABA、GA、IAA、MeJA)響應元件ABRE、GARE-motif、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-motif等。表明,BnMAPK7基因的啟動子具備多種調控作用元件, 可能通過光合作用、逆境和激素等相關信號途徑參與調控甘藍型油菜的生長發育和脅迫應答過程。

表2 甘藍型油菜ProBnMAPK7的主要順式作用元件預測Table 2 Key cis-acting elements of ProBnMAPK7 in Brassica napus

2.2 AtMAPK7 (At2g18170)及BnMAPK7 (Bna A09g09520D)基因在RNA-seq中的表達模式分析

本研究從Arabidopsis RNA-seq Database (http://ipf.sustech.edu.cn/pub/athrna/)中找到了AtMAPK7(At2g18170)基因相關的19,052個均一化文庫。這些文庫數據顯示,AtMAPK7基因除在花粉中表達水平較低外, 在其他組織器官(圖1-A)和不同的生長時期中均有較高表達, 且在25 d的葉片以及15 d和17 d的種胚中具有更高的表達水平(圖1-B), 表明AtMAPK7為非時空特異性表達的基因, 在生長發育的調控過程中可能具有重要作用。同時,AtMAPK7基因還響應多種非生物(圖1-C)以及生物(圖1-D)脅迫應答,AtMAPK7在小菜蛾(Plutella xylostella)和谷禾鐮刀菌(Fusarium graminearum)等生物脅迫以及脫水、滲透、水分、干旱、冷、鹽、損傷、熱和弱光等非生物脅迫下的基因表達水平更高。表明AtMAPK7基因可能在擬南芥的生長發育、非生物和生物脅迫應答過程中具有重要的調控作用。根據本研究室甘藍型油菜中雙11植株不同組織器官及不同生長時期的RNA-seq數據對BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因的時空表達模式進行分析發現,BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因在甘藍型油菜整個生長發育期的不同組織器官中均有表達(圖2-A), 表明該基因的組織表達不具備時空特異性。此外, 根據本課題組前期對甘藍型油菜中油821植株在冷、干旱、熱以及弱光脅迫處理的RNA-seq數據, 分析BnMAPK7(BnaA09g09520D)基因在4種脅迫處理下的響應程度。結果顯示,BnMAPK7基因在上述4種脅迫環境下的基因表達量均上調, 分別是正常環境(Mock)下該基因表達量的4.51、4.34、1.30、4.44倍(圖2-B), 表明BnMAPK7對冷、干旱、熱及弱光脅迫具有正向調控作用。因此, 我們推測,MAPK7基因的表達模式具有保守性, 在植物的生長發育過程以及生物和非生物脅迫等逆境響應過程中具有重要的調控功能。

2.3 ProBnMAPK7的核心區段定位于-467~-239 bp區域

為查找BnMAPK7啟動子的主要活性區域, 本研究將ProBnMAPK7全長序列(ProBnMAPK7-PA)連接至pCambia1305.1表達載體中, 通過農桿菌介導瞬時轉化至本氏煙草葉片。根據順式作用元件的預測結果, 將1612 bp的全長ProBnMAPK7-PA片段首先截短為539 bp長度的ProBnMAPK7-lPB片段和1073 bp長度的ProBnMAPK7-rPB片段(圖3)。GUS染色結果顯示, ProBnMAPK7-PA和ProBnMAPK7-rPB均能夠啟動GUS表達, 而ProBnMAPK7-lPB轉化至煙草葉片后未檢測到GUS信號(圖4)。將ProBnMAPK7-rPB片段截短為212 bp長度的ProBn MAPK7-lPC片段和861 bp長度的ProBnMAPK7-rPC片段(圖3), 僅在ProBnMAPK7-rPC葉片中檢測到GUS信號(圖4)。隨后, 將ProBnMAPK7-rPC片段截短為623 bp長度的ProBnMAPK7-lPD和238 bp長度的ProBnMAPK7-rPD片段(圖3), ProBnMAPK7-lPD葉片中具有較強的GUS信號, 而ProBnMAPK7-rPD葉片中無GUS表達(圖4)。再將ProBnMAPK7-lPD截短為394 bp長度的ProBnMAPK7-lPE片段和229 bp長度的ProBnMAPK7-rPE片段(圖3), 2個片段均能啟動GUS表達, 但ProBnMAPK7-lPE葉片中的GUS信號非常弱, 而ProBnMAPK7-rPE葉片中有較強的GUS表達(圖4)。因此, 我們推測, ProBn MAPK7的核心區段為-467~ -239 bp位置的ProBn MAPK7-rPE區段, 長度為229 bp, 可用于酵母單雜交的文庫篩選。

2.4 pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3在Y1H gold酵母細胞中的毒性及自激活檢測

將3個拷貝的ProBnMAPK7-rPE片段進行串聯重復, 連接至pAbAi表達載體。將線性化后的pAbAi-ProBnMAPK7-rPE×3整合至Y1H gold基因組中, 成功獲得Y1H-Bait重組酵母菌株。同時, 將線性化的pAbAi-p53整合至Y1H gold基因組中, 成功獲得Y1H-p53陽性對照酵母菌株。使用不同濃度梯度的AbA抗生素對Y1H-Bait的本底表達背景進行檢測發現, 陰性對照Y1H gold在不同篩選壓的培養基上均不能生長; 在低濃度AbA的篩選培養基上,陽性對照Y1H-p53及試驗組Y1H-Bait能夠生長, 表明Bait對Y1H gold細胞無毒性。高濃度的AbA對Y1H-p53及Y1H-Bait具有明顯的抑制效應, 在AbA濃度為100 ng mL-1時, Y1H-p53及Y1H-Bait受到明顯的抑制; AbA濃度達到300 ng mL-1時, 二者幾乎不再生長; AbA濃度為500 ng mL-1時, Y1H-p53及Y1H-Bait的生長均被完全抑制(圖5)。表明, Y1H-Bait具有自激活活性, 可使用500 ng mL-1濃度的AbA抑制其本底表達, 進行酵母單雜交文庫篩選。

2.5 甘藍型油菜ProBnMAPK7-rPE核心區段的Y1H文庫篩選獲得3個候選上游調控因子

為查找調控BnMAPK7基因轉錄表達的上游因子, 本研究利用酵母單雜交技術對ProBnMAPK7-rPE核心區段進行文庫篩選, 分離純化后, 采用高保真酶對酵母單菌落進行PCR擴增, 共獲得5個互作菌落。BLAST結果顯示, 共獲得3個候選上游調控因子; 根據擬南芥同源蛋白信息, 將其分別命名為BnNAD1B (NADH dehydrogenase 1B)、BnERD6(Early response to dehydration 6)和BnPIG3 (quinone oxidoreductase PIG3-like), 出現的次數分別為2、2和1次。提取Y1H文庫篩選獲得的酵母質粒, 并分別與Y1H-Bait進行點對點回轉驗證(圖5-B),BnNAD1B、BnERD6和BnPIG3在AbA濃度為500 n g m L-1甚至8 0 0 n g m L-1時, 均能夠與ProBnMAPK7-rPE結合。擬南芥TAIR10數據庫的注釋信息顯示,NAD1B編碼線粒體NAD(P)H脫氫酶的亞基NAD1B, 主要參與細胞呼吸、氧化還原過程及光呼吸過程;ERD6編碼蔗糖轉運蛋白, 主要參與碳水化合物的跨膜轉運, 響應ABA、幾丁質、冷脅迫、鹽脅迫以及缺水脅迫等;PIG3編碼醌氧化還原酶, 屬于鋅結合脫氫酶家族, 主要參與氧化還原過程等(表3)。這些結果與BnMAPK7啟動子順式作用元件預測結果基本一致, 表明甘藍型油菜BnNAD1B、BnERD6和BnPIG3蛋白可能通過與核心區段ProBnMAPK7-rPE相結合, 調控BnMAPK7的轉錄表達, 進而參與光合作用和逆境脅迫應答等過程。

表3 甘藍型油菜ProBnMAPK7酵母單雜交文庫篩選的上游調控因子注釋信息Table 3 Annotation of upstream regulators of ProBnMAPK7 in Y1H library screening assays in Brassica napus

3 討論

MAPKs級聯在進化上是一種高度保守的信號通路。當植物感受到外源刺激時, MAPKs級聯被快速激活并將信號轉入胞內, 通過調控特定的基因簇[6]或翻譯后修飾[10], 引起下游基因表達、磷酸化和去磷酸化、磷脂代謝、鈣調節、蛋白降解等生物學途徑發生變化[8]。位于MAPKs級聯模塊最下游的MAPKs基因被報道, 參與調控植物生長、發育、細胞凋亡等過程, 在應對多種生物及非生物脅迫, 包括冷、熱、氧化脅迫、紫外線、干旱、病原菌侵害等方面具有重要作用[13-15]。本研究室前期根據白菜(Brassica rapa)基因組序列, 獲得了甘藍型油菜中AtMAPK7和Bra037234垂直同源基因的啟動子JX827381.1, 大小為1058 bp[23]。近年來, 得益于測序技術的飛速發展, 甘藍型油菜的測序工作得到了極大的推進, 我們結合擬南芥和甘藍型油菜數據庫,對甘藍型油菜BnMAPK7(BnaA09g09520D)的啟動子序列及其潛在的順式作用元件信息進行了完善,ProBnMAPK7大小為1612 bp。

啟動子的順式作用元件種類和數量的多樣性直接影響基因的表達模式[31]。JX827381.1和ProBnMAPK7序列中, 均具有響應ABA的ABRE元件。研究報道, 擬南芥AtMKK3-AtMAPK7復合體可保護AtMAPK7免受降解[18], 且AtMAPKKK17/18-AtMKK3-AtMAPK7級聯與ABA信號途徑交聯,參與調控ABA介導的植物逆境脅迫應答[19]。玉米ZmMAPK7受到ABA的誘導后, 正向調控ABA介導的滲透脅迫應答[20]。棉花GhMKK3-GhMAPK7途徑受到ABA及干旱誘導, 并通過調控根系和氣孔的水分運輸響應干旱脅迫應答[22]。水稻OsMAPKKK62-OsMKK3-OsMAPK7級聯被報道通過磷酸化修飾調控下游基因的轉錄表達進而負調控種子的休眠過程以及種子萌發期和成熟后期對ABA的敏感性[32]。我們前期對甘藍型油菜進行脅迫處理發現,BnMAPK7基因能夠快速響應ABA, 且轉錄水平明顯上調[23]。表明MAPK7在不同物種中對ABA的響應具有保守性。因此, 我們推測ABRE元件在BnMAPK7響應ABA介導的逆境脅迫應答過程中具有重要作用。另外, JX827381.1和ProBnMAPK7中均存在防御相關的TC-rich repeats元件。擬南芥中,AtMAPK7受到多種生物脅迫的誘導與激活, 包括小菜蛾、谷禾鐮刀菌、黃萎病(Verticillium dahliae)、立枯病、核盤菌等(圖1-C)。棉花GhMAPK7基因被報道也參與調控病原菌的防御過程, 包括立枯病、炭疽病和枯萎病[21]。本課題組前期對甘藍型油菜進行核盤菌脅迫處理發現,BnMAPK7能夠快速響應核盤菌, 轉錄水平在24 h內迅速上調[23]。這些證據表明, ProBnMAPK7中TC-rich repeats元件可能在甘藍型油菜防御相關的過程中扮演著重要角色。值得注意的是, JX827381.1和ProBnMAPK7中還有大量的光照響應元件ACE、Box4、G-box、TCT-motif等。本研究在甘藍型油菜RNA-seq數據中發現,BnMAPK7基因在弱光脅迫處理條件下的轉錄水平顯著上調, 這可能與ProBnMAPK7中存在的光照響應元件相關; 對甘藍型油菜ProBnMAPK7的順式作用元件和BnMAPK7時空表達及逆境響應模式的分析證實了BnMAPK7具有轉錄表達保守性和功能多樣性, 我們推測該基因在生長發育、生物和非生物脅迫應答過程中均具有重要的調控功能。

在MAPKs級聯中, MKK3通過磷酸化激活下游MAPK7, 使得MAPK7參與調控植物的生長發育和抗逆等多種生物學過程。然而, 不依賴于MAPKs級聯的上游因子對MAPK7轉錄調控的分子網絡還很空白。本研究通過農桿菌介導的本氏煙草瞬時表達發現, ProBnMAPK7的核心區段定位于-467~-239 bp, 并通過酵母單雜交技術對BnMAPK7的上游調控因子進行文庫篩選, 獲得了3個潛在的候選因子BnNAD1B、BnERD6和BnPIG3。研究報道, 擬南芥NAD1由NAD1A、NAD1B和NAD1C 3個亞基構成, 是線粒體呼吸鏈NADH脫氫酶復合體(Complex I)的重要組成部分, NAD1的生物活性直接影響線粒體的活性和光呼吸, 參與調控植物的生長發育和初級代謝過程[33-34], 并維持電子傳遞、ATP合成和NADH氧化等過程的正常進行[35-36]。本研究在ProBnMAPK7中發現了大量的光響應順式作用元件, 且BnMAPK7基因在弱光脅迫下的轉錄水平顯著上調, 我們推測, 甘藍型油菜BnNAD1B通過與ProBnMAPK7-rPE核心區段結合, 調節線粒體的生物活性和光呼吸過程, 進而響應植物的非生物脅迫應答。ERD6是一種脫水誘導早期應答轉錄因子基因,存在于細菌、酵母、植物和哺乳動物中, 編碼蔗糖轉運蛋白, 受到缺水和冷脅迫的誘導[37]。植物中ERD6還被報道響應幾丁質、ABA、鹽脅迫等, 可能通過與液泡轉化酶協同作用, 參與調控植物細胞的蔗糖運輸和胞內滲透壓[38]。本研究發現, BnERD6能夠與ProBnMAPK7結合, 并且BnMAPK7基因能夠迅速響應ABA和干旱脅迫處理, 表明BnERD6可能是BnMAPK7在轉錄水平上響應ABA和干旱的重要上游調控因子。PIG3編碼醌氧化還原酶類蛋白, 與人p53誘導基因PIG3同源, 研究表明,PIG3在人的腫瘤及癌癥中參與平衡氧化還原過程及DNA損傷[39-40]。對擬南芥防御信號的研究過程中發現,AtPIG3具有鋅結合脫氫酶活性, 可能在防御過程中增強植株的抗氧化能力[41-42]。本試驗結果顯示,BnPIG3蛋白能夠與ProBnMAPK7-rPE結合, 表明甘藍型油菜BnPIG3和BnMAPK7可能在氧化還原過程中具有一定的生物學意義。基于ProBnMAPK7的酵母單雜交文庫篩選, 挖掘了不依賴于MAPKs級聯途徑的BnMAPK7的上游調控因子, 進一步證實了ProBnMAPK7中的順式作用元件在生長發育和逆境脅迫應答過程中的調控作用。因此, 對BnMAPK7功能的深入研究必將大大推動植物MAPKs級聯途徑在提高甘藍型油菜生長發育和抗逆等機制中的應用,為改良甘藍型油菜品質、培養抗逆新品種提供重要的理論依據。

4 結論

從甘藍型油菜中油821品種基因組DNA中克隆了BnMAPK7啟動子ProBnMAPK7, 全長1612 bp,包含響應光照、激素及逆境脅迫等順式作用元件ACE、MRE、ABRE、CGTCA-motif和TC-rich repeats等。MAPK7在擬南芥和甘藍型油菜中, 在各個組織器官及各個時期中均有表達, 并響應生物及非生物脅迫, 證實了啟動子順式作用元件的功能。此外,ProBnMAPK7的核心區段定位于-467~-239 bp(ProBnMAPK7-rPE)區段。Y1H文庫篩選到3個上游候選調控因子: BnNAD1B、BnERD6和BnPIG3。本研究為植物MAPKs級聯途徑的功能研究奠定了基礎, 也為合理利用MAPKs基因啟動子以改良作物的生長發育和抗逆性提供了依據。

附圖1 甘藍型油菜ProBnMAPK7的序列及其順式作用元件Fig. S1 Sequence of ProBnMAPK7 and its cis-acting elements in Brassica napus