病毒介導(dǎo)的GFP-ATG8在小麥上的表達和在自噬活性監(jiān)測上的應(yīng)用

胡蕊潔 楊向蕓 賈 磊 李玉如 項 月 岳潔瑜 王華忠

天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 天津市動植物抗性重點實驗室, 天津 300387

細胞自噬(autophagy, 簡稱自噬)與植物生長、發(fā) 育、衰老、細胞死亡和逆境響應(yīng)等過程密切相關(guān)[1-3]。自噬結(jié)構(gòu)的觀察和自噬活性的監(jiān)測是開展自噬調(diào)節(jié)機制和生理功能研究的必要手段, 定位于自噬膜上的ATG8是觀察細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的重要靶標。具體研究中, 通常將熒光蛋白標記的ATG8在細胞或個體水平進行過表達, 繼而采用熒光顯微技術(shù)對其細胞內(nèi)熒光進行觀察和分析[4]。由農(nóng)桿菌和基因槍等介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是獲得目的基因過表達植株的常用技術(shù),但該類技術(shù)在包括小麥在內(nèi)的多數(shù)植物上的使用涉及繁瑣的組織培養(yǎng)過程和對無菌操作的嚴格要求,獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期長, 工作量大。近年來發(fā)展起來的病毒介導(dǎo)的過表達(virus-mediated over-expression,VOX)技術(shù)為快速獲得目的基因的過表達植株提供了一個新的技術(shù)選擇[5]。

病毒是轉(zhuǎn)運外源基因的天然載體, 可通過高效的侵染過程將攜帶在其基因組上的目的基因?qū)氲奖唤臃N細胞中進行表達, 還可以通過病毒粒子的增殖和移動將目的基因?qū)氲剿拗鱾€體的非接種位置進行表達。植物上被開發(fā)為載體的病毒主要是RNA病毒, 利用此類載體的具體技術(shù)包括VOX和病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)兩類, 后者利用了RNA病毒的復(fù)制中間體dsRNA誘發(fā)的RNAi效應(yīng)[6-7]。病毒的宿主種屬特異性決定了以特定病毒開發(fā)出來的VOX/VIGS技術(shù)只能應(yīng)用于特定范圍的宿主植物。重要農(nóng)作物小麥上, 大麥條斑花葉病毒BSMV (barley stripe mosaic virus)是唯一被廣泛應(yīng)用于VIGS的病毒[7]。BSMV也能應(yīng)用于VOX, 但其載體能穩(wěn)定攜帶的基因片段較小(小于450~500 bp), 而且目的基因只能以與病毒γb基因融合的形式進行表達[5,8]。最近, 馬鈴薯X病毒屬單分子正義RNA病毒——狗尾草花葉病毒FoMV (foxtail mosaic virus)也被開發(fā)為可在小麥上應(yīng)用的VIGS/VOX載體, 該載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在煙草葉片中表達病毒基因組RNA和組裝病毒粒子, 隨后使用含有病毒粒子的煙草汁液摩擦接種小麥葉片[5,9-10]。采用FoMV-VOX技術(shù)可在小麥上介導(dǎo)長達1800 bp的基因以非融合的形式進行表達[5]。與基因槍、農(nóng)桿菌等介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)相比, 使用VOX技術(shù)獲得目的基因的過表達植株無需繁瑣的組織培養(yǎng)過程, 具備簡便、快速的特征。

自噬是一種保守的真核生物細胞內(nèi)物質(zhì)分解和循環(huán)利用機制。在自噬過程中, 細胞質(zhì)內(nèi)待降解底物被包裹進雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體, 隨著自噬小體外膜與液泡(動物是溶酶體)膜的融合, 內(nèi)膜及包裹的底物(此時稱為自噬小泡)進入液泡腔被分解[11]。多種自噬相關(guān)(autophagy-related, ATG)因子參與到自噬小體組裝、底物選擇、自噬小體與液泡的融合及這其中的信號調(diào)控等過程[3,11]。自噬過程和ATG因子在包括酵母、動物和植物在內(nèi)的真核生物中非常保守[1,12]。ATG8是自噬核心機制中研究得最清楚的ATG因子, 其在被蛋白酶ATG4加工后通過一個類泛素化過程與脂類分子磷脂酰乙醇胺連接定位于自噬結(jié)構(gòu)的內(nèi)、外膜表面, 繼而以互作的方式募集其他ATG因子共同作用于自噬小體的組裝及與液泡的融合等過程[13]。鑒于ATG8對自噬膜的標志性裝飾作用, 其與GFP或RFP的融合蛋白定位到自噬膜上后所呈現(xiàn)的點狀熒光可作為細胞內(nèi)自噬小體和自噬小泡等自噬結(jié)構(gòu)存在的證據(jù), 點狀熒光的數(shù)量可用來表征細胞內(nèi)的自噬活性[4]。近年來, 模式植物擬南芥和水稻上都報道了過表達GFP/RFP-ATG8轉(zhuǎn)基因材料的獲得和在自噬分子機制、生理功能研究上的應(yīng)用[14-15], 但此類材料在小麥上還未見報道, 極大地限制了小麥上相關(guān)研究的開展。鑒于FoMVVOX技術(shù)在小麥上的成功使用和其簡便、快速的特征, 有必要嘗試采用這一技術(shù)在小麥上制備GFP/RFP-ATG8的過表達植株。

高等生物ATG8是由多個成員構(gòu)成的基因家族。此前我們在小麥上鑒定了9個ATG8基因(TaATG8a-8i), 證實它們參與了小麥的細胞自噬過程[16]。本研究選擇TaATG8a, 采用FoMV-VOX技術(shù)在小麥幼苗植株上表達了GFP-TaATG8a融合蛋白, 通過熒光觀察對融合蛋白在葉片和根組織中的表達情況和亞細胞定位情況進行了鑒定, 建立了在小麥活體植株上以過表達的GFP-TaATG8a為靶標進行自噬活性監(jiān)測的技術(shù)平臺。研究結(jié)果為深入探索重要農(nóng)作物小麥的自噬調(diào)控機制和生理功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本氏煙草(Nicotiana benthamiana)和小麥品種揚麥158種子播種于裝有營養(yǎng)土和蛭石的盆缽中, 置于23℃、16 h光照/8 h黑暗條件的光照培養(yǎng)箱中生長。4~5周齡的本氏煙草植株葉片用于農(nóng)桿菌agroinfiltration, 二葉期的小麥幼苗用于病毒接種。

1.2 GFP-TaATG8a融合基因的VOX載體構(gòu)建

使用基于FoMV的VOX載體[5]構(gòu)建GFPTaATG8a融合基因的表達載體, 該載體上含有35S啟動子驅(qū)動的FoMV基因組cDNA, 其上設(shè)計有2個重復(fù)的亞基因組啟動子, 前一個亞基因組啟動子用于驅(qū)動外源基因的表達。設(shè)計合成引物對Fo-G8a-F (ACAGTCGACAGCTAT ATGGTGAGCAA GGGCGAG)和Fo-G8a-R (GCGGTCGTTGAGTGT CTAGAGCAATCCGAAGGTGT), 引物5′端添加了載體上插入位點兩側(cè)的同源臂(下畫線序列)。使用該引物對, 以GFP-TaATG8a融合基因表達載體pGFPG8a[16]為模板, 使用高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)擴增GFP-TaATG8a片段。使用無縫克隆試劑盒pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)將擴增片段替換原始VOX載體上ClaI和XbaI之間的GFP基因片段, 從而構(gòu)建GFP-TaATG8a的VOX載體pFo-GFP-TaATG8a, 通過DNA測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)對構(gòu)建載體的正確性進行確認。將pFo-GFP-TaATG8a轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 (pSoupp19)的化學(xué)感受態(tài)細胞(上海唯地生物技術(shù)有限公司)中, 轉(zhuǎn)化過程參考感受態(tài)細胞的使用手冊進行。

1.3 煙草葉片Agroinfiltration

將固體培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌單菌落接種于3 mL含50 μg mL–1卡那霉素和25 μg mL–1利福平的LB液體培養(yǎng)基中, 29℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例將培養(yǎng)液放大到10 mL含相同抗生素及20 mmol L–1MES、20 μmol L–1乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12 h。離心收集菌體后將菌體懸浮于適量MMA溶液(10 mmol L–1MES, 100 μmol L–1乙酰丁香酮, 10 mmol L–1MgCl2, pH 5.7)并將菌體濃度調(diào)至OD600值約為0.3, 29℃條件下靜置3 h。使用1 mL去針頭的無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液從背面注射至煙草葉片中。注射后的煙草于黑暗條件下保存24 h后轉(zhuǎn)移到正常條件下生長。注射農(nóng)桿菌7 d后, 將注射過的煙草葉片在研缽中用液氮研磨成粉末, 按1∶2 (w/v)的比例加入預(yù)冷的20 mmol L–1PBS緩沖液(pH 7.2)制備成含病毒的煙草汁液。煙草汁液可直接用于小麥接種或保存于-80℃冰箱。

1.4 小麥幼苗植株的病毒摩擦接種

按1% (w/v)的比例在煙草汁液中添加滅菌的硅藻土(Celite 545, Sigma)配成病毒接種液, 將接種液摩擦接種于二葉期小麥幼苗第2葉, 接種后對幼苗進行超純水噴霧處理和套袋保濕24 h, 隨后置于正常條件下培養(yǎng)。

1.5 饑餓和藥物處理

使用去針頭的1 mL注射器將100 μmol L–1E-64D或1% DMSO (溶劑對照)直接從煙草葉片背面或從小麥葉片背面主脈切口處(提前用刀片制備)注射到組織中, 然后將葉片剪下置于蒸餾水中并保存于黑暗條件下進行離體饑餓處理。根組織的饑餓處理則是將小麥根部剪下置于蒸餾水中并保存于黑暗條件下, 蒸餾水中添加終濃度為1 μmol L?1的刀豆素A (Concanamycin A)或1% DMSO (溶劑對照)。

1.6 熒光觀察

使用熒光顯微鏡(Leica DM5000B)觀察煙草葉片組織中的GFP和GFP-TaATG8a熒光, 使用體式熒光顯微鏡(Nikon SMZ25)觀察小麥葉片和根組織中的GFP和GFP-TaATG8a熒光。使用激光共聚焦熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti2)觀察煙草葉表皮細胞和小麥葉表皮、葉肉、根細胞中GFP和GFP-TaATG8a的定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 FoMV介導(dǎo)的GFP-TaATG8a在小麥上的表達

將攜帶GFP(723 bp)或GFP-TaATG8a(1092 bp)基因的FoMV基因組RNA表達載體(圖1)分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌后, 使用Agroinfiltration方法轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片。轉(zhuǎn)化7 d后在煙草葉片中能夠觀察到明亮的大片綠色GFP或GFP-TaATG8a熒光(圖2)。

使用轉(zhuǎn)化后7 d的煙草葉片汁液摩擦接種小麥幼苗第2葉。在接種7 d后的第2葉和20 d后新長出的第3葉上均觀察到成片GFP或GFP-TaATG8a綠色熒光(圖3), 在接種20 d后的根尖以外的根組織中也觀察到同樣的綠色熒光(圖4)。以上結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化煙草葉片中發(fā)生了FoMV基因組RNA的轉(zhuǎn)錄和病毒粒子的組裝, 煙草汁液中的病毒粒子可系統(tǒng)性侵染小麥幼苗葉片和根尖以外的根組織, 并介導(dǎo)其攜帶目的基因在侵染組織中的過表達。

2.2 融合蛋白GFP-TaATG8a在葉片細胞中的定位和自噬活性監(jiān)測

對過表達GFP或GFP-TaATG8a的煙草、小麥植株葉片進行24 h離體黑暗條件下的饑餓處理以激活自噬, 對部分葉片同時施加液泡蛋白酶抑制劑E-64D處理以阻斷自噬小泡的降解、積累自噬結(jié)構(gòu)。在饑餓處理的煙草葉表皮細胞(圖5)和小麥葉表皮細胞(圖6)中, GFP蛋白的熒光彌散于細胞質(zhì), 不受E-64D處理的影響; GFP-TaATG8a蛋白的熒光模式明顯受到E-64D處理的影響, 未經(jīng)E-64D處理的情況下彌散于細胞質(zhì), 經(jīng)E-64D處理的情況下則呈現(xiàn)代表自噬結(jié)構(gòu)的綠色亮點。在饑餓處理的小麥葉肉細胞中也觀察到施加E-64D處理導(dǎo)致的GFPTaATG8a綠色亮點的出現(xiàn)(圖7)。以上結(jié)果表明, 采用FoMV-VOX技術(shù)表達的GFP-TaATG8a在激活自噬的小麥葉表皮和葉肉細胞中能夠定位到自噬膜上,E-64D的使用可有效地積累細胞內(nèi)表征自噬結(jié)構(gòu)的GFP-TaATG8a熒光亮點, 進而可以根據(jù)自噬結(jié)構(gòu)的數(shù)量評價自噬活性的高低。

2.3 融合蛋白GFP-TaATG8a在小麥根細胞中的定位和自噬活性監(jiān)測

對過表達GFP-TaATG8a的小麥植株根組織進行24 h離體黑暗條件下的饑餓處理以激活自噬, 對部分根組織同時施加液泡膜質(zhì)子泵抑制劑即液泡腔酸化抑制劑刀豆素A處理以阻斷自噬小泡的降解、積累自噬結(jié)構(gòu)。熒光觀察發(fā)現(xiàn), 在未經(jīng)饑餓和刀豆素A處理的根細胞中, GFP-TaATG8a的熒光彌散于整個細胞; 而在單獨施加饑餓處理以及同時施加饑餓和刀豆素A處理的根細胞中均產(chǎn)生大量的代表自噬結(jié)構(gòu)的GFP-TaATG8a點狀熒光(圖8)。這一結(jié)果表明采用FoMV-VOX技術(shù)表達的GFP-TaATG8a能夠在激活自噬的根細胞中定位到自噬膜上, 可用于根細胞中自噬結(jié)構(gòu)的觀察和自噬活性的監(jiān)測。此外,在觀察饑餓誘導(dǎo)的小麥根細胞中的自噬結(jié)構(gòu)時, 刀豆素A的使用并非必須。

3 討論

基于病毒的VIGS和VOX技術(shù)在植物基因和蛋白功能研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[5,7]。本研究采用最近被開發(fā)的FoMV-VOX技術(shù)在小麥幼苗中成功實現(xiàn)了GFP和GFP-TaATG8a基因的過表達, 驗證了該技術(shù)的可靠性[5]。從轉(zhuǎn)化煙草葉片開始, 使用FoMV-VOX技術(shù)可在30 d之內(nèi)獲得目的基因的過表達小麥植株; 含有病毒粒子的煙草汁液可長期低溫保存, 使用保存的煙草汁液接種小麥可進一步簡化技術(shù)流程、縮短實驗周期。此前的FoMV-VOX應(yīng)用報道只關(guān)注了目的基因在葉組織中的表達情況[5]。本研究發(fā)現(xiàn), 在葉片上接種的FoMV病毒粒子除可介導(dǎo)目的基因在葉表皮和葉肉細胞中表達外, 還可借助病毒粒子的系統(tǒng)侵染特性介導(dǎo)目的基因在根組織中高效表達。因此, FoMV-VOX技術(shù)對小麥葉和根組織的基因功能研究都適用。鑒于FoMV-VOX技術(shù)的這些簡便、快速的比較優(yōu)勢, 其在一定程度上可代替常規(guī)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)用于小麥過表達植株的制備。需要注意的是, 本研究沒有在旺盛分裂的小麥根尖細胞中觀察到FoMV-VOX介導(dǎo)的GFP或GFP-TaATG8a基因的表達。FoMV-VOX技術(shù)的效果在不同小麥品種上變化較大, 其原因可能是不同基因型的材料對FoMV侵染的敏感性有較大的差異[5]。本研究通過品種篩選發(fā)現(xiàn)國內(nèi)品種揚麥158對FoMV-VOX較為敏感, 適合作為受體材料采用該技術(shù)開展基因功能研究。

自噬的調(diào)控機制和生理功能研究離不開對細胞內(nèi)自噬活性的實時監(jiān)測。ATG8由于其特征性的自噬膜定位而成為監(jiān)測自噬活性的重要靶標, 熒光蛋白標記的ATG8所呈現(xiàn)的點狀熒光表征了自噬小體和自噬小泡等自噬結(jié)構(gòu)的存在[4]。此前我們分別采用PEG-Ca2+介導(dǎo)和基因槍介導(dǎo)的瞬時表達方法在原生質(zhì)體細胞和葉表皮細胞中證明了利用GFP-ATG8融合蛋白監(jiān)測小麥自噬的可行性[17]。本研究在采用FoMV-VOX技術(shù)制備的GFP-TaATG8a過表達小麥植株的葉表皮、葉肉以及根細胞中觀察到了受饑餓誘導(dǎo)的表征自噬結(jié)構(gòu)的點狀熒光, 表明制備的GFP-TaATG8a過表達植株可以應(yīng)用于小麥生長發(fā)育過程中或環(huán)境因素響應(yīng)過程中的自噬活性監(jiān)測和自噬功能研究。自噬是一個連續(xù)的動態(tài)過程(自噬流,autophagic flux), 底物的捕獲、自噬小體的成熟、自噬小體與液泡的融合以及自噬小泡在液泡中的降解等都是非常快速的中間環(huán)節(jié), 難以在活細胞中捕捉到相應(yīng)的信息。因此, 為了放大反映自噬活性的信息, 通常使用液泡蛋白酶抑制劑E-64D或液泡酸化抑制劑刀豆素A抑制自噬小泡降解這一終端環(huán)節(jié),達到積累自噬結(jié)構(gòu)以方便監(jiān)測自噬活性的目的[4]。本研究中, E-64D的使用可有效地在饑餓處理的小麥葉片細胞中積累自噬結(jié)構(gòu), 方便了自噬活性的監(jiān)測; 而刀豆素A的使用在饑餓處理的小麥根組織上卻并非必須, 在未經(jīng)刀豆素A處理的根細胞中也能觀察到大量的饑餓誘導(dǎo)的自噬結(jié)構(gòu)積累。

4 結(jié)論

本研究采用FoMV-VOX技術(shù)在小麥幼苗上實現(xiàn)了自噬結(jié)構(gòu)靶標蛋白基因GFP-TaATG8a在多種組織類型中的過表達, 該技術(shù)流程具有簡單、快速的優(yōu)勢。GFP-TaATG8a蛋白在激活自噬的細胞中呈現(xiàn)表征自噬結(jié)構(gòu)的點狀熒光, 因此使用FoMV-VOX技術(shù)制備的GFP-TaATG8a過表達植株可以應(yīng)用于小麥的自噬活性調(diào)節(jié)機制和生理功能研究。