基于農藝及品質性狀與SSR標記的青貯玉米品種遺傳多樣性分析

劉少榮 楊 揚 田紅麗 易紅梅 王 璐 康定明 范亞明 任 潔 江 彬 葛建镕 成廣雷,* 王鳳格,*

1 北京市農林科學院玉米研究中心 / 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097; 2 中國農業大學農學院, 北京100193

玉米是中國重要的糧飼兼用作物, 2019年種植面積為4128萬公頃[1], 超過稻谷和小麥, 位居農作物第一。隨著中國糧改飼產業結構調整及畜牧業發展, 飼用玉米, 特別是青貯玉米的種植面積在逐步擴大, 為畜牧業供給充足的優質飼料[2]。青貯玉米作為優質飼料, 具有產量高、品質好、飼用價值高等特點, 已在畜牧業發展、生態環境保護、農業增收中占有不可或缺的地位, 大力開展青貯玉米的品種選育是解決當下畜牧業迅速發展帶來的飼料缺乏問題的有效途徑[3]。然而中國青貯玉米研究起步較晚,雖然審定了不少品種, 但對這些品種的遺傳來源并不清楚, 所以亟需摸清我國青貯玉米品種遺傳背景現狀。近年來, 對青貯玉米的研究主要集中在高產優質[4-5]、生態適應性[6-8]和配套栽培技術[9-10]等方面,關于青貯玉米遺傳多樣性分析的報道不多。

遺傳多樣性分析是作物種質資源研究的一種重要手段, 旨在了解和掌握不同品種之間的遺傳差異,為推動植物育種與遺傳改良奠定基礎。遺傳多樣性分析可以從形態學性狀和分子標記2個方面進行,形態學性狀是從植物的表型性狀來區分品種差異,分子標記是通過遺傳物質反映品種間遺傳變異程度[11]。迄今為止, 形態學性狀已被廣泛應用到玉米[12]、谷子[13]、水稻[14]、馬鈴薯[15]等農作物的遺傳多樣性研究中。在利用形態學性狀對青貯玉米品種進行遺傳多樣性研究方面, 柴華[16]用10個形態學標記將36個青貯玉米自交系劃分為五大類, 為選育優質青貯玉米品種提供依據; 吳建忠等[17]基于22個品質性狀對14個青貯玉米品種進行遺傳變異分析, 發現脂肪、木質素和淀粉的變異系數較大, 分別為20%、19%和16%, 為青貯玉米的品質改良提供了參考。SSR標記具有檢測簡便快捷、多態性高和重復性好等優點, 被迅速推廣應用。李齊向等[18]采用23對SSR標記對4個代表國內主要雜種優勢群的普通玉米品種和65個青貯玉米自交系進行聚類分析, 將大部分未知系譜來源的青貯玉米劃分為Lancaster群、旅大紅骨類群、塘四平頭群和Reid群, 初步明確了其系譜來源。

國內外關于玉米遺傳多樣性的研究, 主要聚集在種質資源多樣性評價、雜種優勢群劃分等方面,而針對青貯玉米品種遺傳多樣性的評估鮮有報道。本研究對141個來源于2002—2020年國家及各省區(市)審定的青貯玉米品種, 基于其13個農藝及品質性狀和40個SSR標記, 并結合品種來源的生態區,進行了遺傳多樣性分析, 以了解各生態區青貯玉米品種的農藝、品質性狀及遺傳分化特點, 為青貯玉米的新品種選育及推廣種植提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料選自2002—2020年通過國家及各省區(市)審定的141個青貯玉米雜交種。參照2016年國家青貯玉米品種區域試驗的生態組別劃分, 并結合播種區域、播種時間、品種類型和選育單位等因素將供試品種劃分為4個生態區, 分別為東華北區、黃淮海區、西北區和南方區, 詳細品種審定來源及生態區分布見表1。農藝及品質分析材料: 在141個青貯玉米品種中, 有19個品種具有多個生態區或年份審定來源, 其中13個品種具有2個審定來源, 3個品種具有3個審定來源, 3個品種具有4個審定來源,即青貯玉米樣品由141個擴增到169個。SSR標記分析材料: 包括141個青貯玉米品種和5個普通玉米品種(德美亞1號、鄭單958、蘇玉29、先玉335、農大108)。從試驗材料中選用5個國家或省區(市)級青貯玉米區試對照品種(雅玉青貯8號、雅玉青貯26、大京九26、京九青貯16、桂青貯1號)、2個推廣面積較大的糧飼兼用品種(中玉335、京科968)和5個國家普通玉米區試對照品種作為參考對照。

表1 樣品信息統計Table 1 Sample information statistics

1.2 試驗方法

1.2.1 農藝及品質性狀 農藝及品質數據均來自于國家及各省區(市)青貯玉米審定公告, 其中包括13個性狀, 分別為生育期、株高、穗位高、綠葉數、穗長、穗行數、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、淀粉、干重、鮮重和種植密度。凱氏定氮法測定粗蛋白含量, 旋光法測定淀粉含量, Van Soest法測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量, 具體步驟參見GB/T25882-2010[19], 其他性狀測定方法參見審定公告。

1.2.2 SSR標記 采用的40對SSR引物, 均為玉米品種鑒定行業標準中發布的引物, 具有多態性好,均勻分布在玉米的10條染色體上的特征, 具體引物名稱、序列及片段長度等信息參考已發表的文獻[20-21]。

1.2.3 DNA制備和SSR基因分型 采用改良CTAB法[22]提取供試材料基因組DNA, DNA濃度和質量用紫外分光光度計(Nanodrop 2000)測定, 根據測量值調節工作液濃度。SSR-PCR體系: 反應液總體積為20 μL, 包括2×TaqPlus Master Mix 10 μL,ddH2O 7.75 μL, 引物0.25 μL和DNA樣品2 μL。PCR程序: 預變性95℃ 5 min;變性94℃ 40 s,退火60℃35 s, 延伸72℃ 45 s, 35個循環; 延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR產物檢測: 采用10重PCR產物電泳檢測的方法。向96孔電泳板的單個孔中分別加入2 μL 10重PCR的混合產物、10 μL含有1% GS3730-500分子量內標的甲酰胺。將上述混合樣品放入PCR儀中95℃變性5 min, 4℃保存10 min, 2000轉 min–1離心30 s后, 于ABI 3730XL DNA分析儀上進行熒光毛細管電泳。預電泳時間2 min, 15 kV, 電泳時間30 min, 15 kV, 電泳原始數據由Data Collection軟件收集, 用SSR Analyser (v1.2.4)指紋分析器[23]對電泳數據基因分型分析。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS 25軟件對農藝及品質數據進行平均值、標準差和極值的統計, 并進行方差分析; 利用Microsoft Excel 2016計算變異系數和Simpson多樣性指數?；赗語言scale函數對農藝及品質數據標準化處理, 再利用dist函數, 選擇“euclidean”方法計算出品種間的歐式距離。將上述品種間的歐式距離矩陣導入PowerMarker V3.25[24]軟件得到農藝及品質性狀NJ (Neighbor-Joining)聚類結果,結合MEGA7[25]軟件繪制聚類圖。采用Power Marker V3.25軟件對SSR基因型數據進行分析,計算不同生態區品種的等位變異數、基因型數、基因多樣性、雜合度和PIC值。同時基于Nei’s(1973)方法計算品種間的遺傳距離, 得到SSR標記NJ聚類結果, 結合MEGA7軟件繪制聚類圖?；跉W式距離矩陣和遺傳距離矩陣, 選用多變量統計分析軟件MVSP V3.22[26]對品種進行主成分分析并繪制PCA圖。

2 結果與分析

2.1 農藝及品質性狀遺傳多樣性分析

對169個青貯玉米樣品的13個農藝及品質性狀進行了描述性統計(表2), 各性狀存在不同程度的變異, 變異系數分布在10.30%~30.31%之間,平均為16.01%, 其中干重和酸性洗滌纖維的變異系數超過20%, 其他性狀變異系數在10%~20%之間。Simpson多樣性指數的變化區間在0.50~0.71, 平均為0.60,穗長多樣性指數最高, 粗蛋白多樣性指數最低。在青貯玉米品質性狀中, 粗蛋白和酸性洗滌纖維表現出較豐富的遺傳多樣性。

表2 169個樣品的農藝及品質性狀特征Table 2 Agronomic and quality characteristics of 169 samples

基于13個農藝及品質性狀對供試品種進行聚類分析, 從圖1-A可知, 169個青貯玉米樣品可被劃分為5個組, 大部分樣品聚集在X3、X4組。X1組包括以桂青貯1號為代表的19個樣品, X2組包括以中玉335為代表的13個樣品, X3組包括以京九青貯16、京科968及雅玉青貯8號為代表的72個樣品, X4組包括以大京九26為代表的45個樣品, X5組包括以雅玉青貯26為代表的20個樣品。對農藝及品質性狀聚類組群進行主成分分析(圖1-B), 根據5個聚類組群的具體分布情況將坐標圖劃分為I、II、III、IV四個區域, 從整體上來看, 各組群分布均相對集中, X1、X5組分布在I、III區, 但主要集中在III區,X2組主要分布在I區, X3組主要分布在I、II區, X4組分布在III、IV區。各組群坐標分布結果與聚類分組結果基本一致。

2.2 SSR標記遺傳多樣性分析

40對SSR引物在141個青貯玉米品種中共檢測到482個等位變異, 每對引物等位變異數量范圍為3~27個, 平均為12.05個; 基因多樣性的變化范圍為0.29~0.90, 平均為0.71; 雜合率的變化范圍為0.27~0.94, 平均為0.68; PIC的變化區間為0.27~0.88, 平均為0.68。

以普通玉米為參考對照, 分析青貯玉米品種的遺傳背景, 對141個青貯玉米品種和5個普通玉米品種進行聚類分析(圖2-A), 供試品種被劃分為5個組。S1組包括以雅玉青貯28、雅玉青貯8號和德美亞1號為代表的33個品種, S2組包括以大京九26為代表的24個品種, S3組包括以京科968和鄭單958為代表的14個品種, S4組包括以京九青貯26、蘇玉29和先玉335為代表的62個品種, S5組包括以中玉335和農大108為代表的13個品種。SSR標記聚類組群的主成分分析顯示, 雖然存在極少數的離散品種, 但整體上各組群分布相對集中(圖2-B),基本上各自占據相應的位置。S1、S3組分布均主要集中在II區, S2、S5組在III和IV區均有分布, S4組分布在I、II、III區, 但主要聚集在I、III區。各組群坐標分布結果與聚類分組結果一致, 且兩者分析結果可以相互佐證。

2.3 不同生態區品種遺傳多樣性分析

為了探究各生態區品種間是否存在遺傳差異,對不同生態區品種進行方差分析及遺傳多樣性比較(表3和表4)。結果表明, 東華北品種各性狀相對居中, 基因多樣性、雜合度和PIC均最低, 分別為0.68、0.65和0.64; 黃淮海品種生育期最短, 達到顯著水平, 等位變異數最低, 為7.40; 西北品種生育期、穗位高、干重和鮮重最高, 且均達到顯著水平,等位變異數和基因型數均最高, 分別為9.13和16.30;南方品種穗長、穗行數和鮮重最低, 粗蛋白最高, 且均達到顯著水平, 基因型數最低, 為10.30, 基因多樣性、雜合度和PIC均為最大, 分別為0.71、0.72和0.68。結果表明, 西北和南方品種表現出豐富的遺傳多樣性, 出現不同程度的性狀分化, 產生了具有地方性特征的性狀特點。

表3 4個生態區品種農藝及品質性狀的方差分析Table 3 Analysis of variance of agronomic and quality traits of varieties from four ecological regions

表4 4個生態區品種間的遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversity among varieties from four ecological regions

分析不同生態區品種在兩類方法的聚類分布情況。由農藝及品質性狀聚類可知(圖2-A), 有3個生態區的大多數品種聚在相同的組群, 其中37個西北樣品(62.7%)聚于X4組, 28個黃淮海樣品(84.8%)和13個南方樣品(59.1%)聚于X3組, 但東華北樣品分布相對離散, 24個樣品(43.6%)聚于X3組, 11個樣品(20%)聚于X1組。各生態區品種之間的遺傳距離結果表明, 南方品種與東華北、黃淮海和西北品種遺傳距離較大, 分別為0.054、0.047、0.046, 而東華北、黃淮海和西北品種兩兩間遺傳距離較小, 均在0.01左右。由SSR標記聚類可知(圖2-A), 15個南方品種(75%)聚于S1組, 東華北、黃淮海和西北品種主要聚于S4組, 分別為23個(48.9%)、11個(40.7%)和22個(46.8%)。比較2種聚類結果發現, 兩者都能將南方品種聚集在一起, 但農藝及品質性狀還能將黃淮海、西北品種聚集在一起。

3 討論

3.1 青貯玉米雜交品種的品質性狀評價及遺傳多樣性分析

粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維和淀粉是反映青貯玉米品質的重要指標。粗蛋白提供動物的蛋白質和氨化物兩大營養物質, 其含量越高, 青貯玉米品質越好。中性洗滌纖維和酸洗洗滌纖維是評價動物消化率的重要指標, 其含量越低, 動物可消化的干物質越多。根據2010年國家頒布的青貯玉米品質分級標準[19], 在本研究2002—2020年通過國家及各省區(市)審定的169個青貯玉米樣品數據中,136個樣品達到粗蛋白國家一級標準(≥7%), 56個樣品達到中性洗滌纖維國家一級標準(≤45%), 86個樣品達到酸性洗滌纖維國家一級標準(≤23%), 40個樣品達到淀粉含量國家一級標準(≥25%), 且品種質量呈現為逐年提高的趨勢。以上表明育種家在青貯玉米的研究方面得到深度和廣度拓展, 更加注重飼喂效果, 把為牲畜養殖提供更多能量作為出發,使選育品種的目標更明確, 體現中國培育出的青貯玉米新品種質量越來越好[27]。

青貯玉米品種遺傳多樣性評價可為新品種選育、品種生產應用提供重要參考。在供試品種的產量及品質性狀分析中, 發現干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維遺傳多樣性較豐富。本文研究結果與吳建忠等[17]、吳欣等[28]相比較, 干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維的變異系數均高出許多, 這可能與品種數目及種植區域差異大有關。以上研究表明青貯玉米品種的干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維存在較大的改良空間, 可為以后優質品種選育提供方向。本研究在王鳳格等[29]分析32個青貯玉米品種遺傳多樣性的基礎上將樣品數增至141個, 發現等位變異數、基因多樣性、PIC、雜合率普遍升高, 但與易紅梅等[30]研究參加2014—2019年國家區試的127個青貯玉米品種結果基本一致, 這可能受樣品總數大小的影響。

3.2 不同生態區品種遺傳多樣性

從生態區角度來對青貯玉米進行遺傳多樣性分析, 能更精準的了解中國各種植區域品種的遺傳分化特點。根據方差分析及遺傳多樣性結果表明, 西北和南方品種基因多樣性、雜合度、PIC指標略高于東華北和黃淮海品種, 顯現出豐富的遺傳多樣性,且出現了明顯的性狀分化現象。分析其可能原因,有如下3點: (1) 生態環境差異。不同生態區的地形、氣候、土壤條件等因素影響玉米品種形態性狀表達。(2) 生態區地理跨度及需求區域差異。東華北和黃淮海品種種植區域跨度較小, 而西北和南方品種種植區域跨度較大, 且青貯玉米主要需求區域在西北和南方地區, 兩地區品種類型多, 故遺傳多樣性較高。(3) 不同生態區畜牧結構及生產要求不同。西北生態區畜牧業發展迅速, 飼料相對缺乏, 對青貯玉米品種的產量要求較高, 故西北品種生育期及生物產量等性狀指標高, 產生性狀分化現象。

農藝及品質性狀聚類顯示, 同一生態區的大部分品種聚集在一起。分析其可能原因為不同生態區的育種目標及生產需求不同, 即不同生態區形成了適應當地需求的育種模式, 對目標性狀存在定向選擇, 導致品種出現一定的性狀分化。除此之外, 該結果體現了我國青貯玉米的品種選育正在逐步出現針對于特點區域、生態區進行品種改良的情況。SSR標記聚類顯示, 15個南方品種(75%)聚于S1組, 而其他組群中各生態區品種摻雜, 單生態區品種無明顯聚集現象, 結合不同生態區之間的遺傳距離, 表明僅南方品種有傾向于聚在一起。分子聚類結果說明,東華北、西北和黃淮海生態區品種基因來源復雜,關鍵種質資源接近, 不同品種間存在基因交流, 造成親緣關系接近、遺傳差異較小。同時, 南方地區品種與其他生態區品種的遺傳分化現象在一定程度上反映出青貯玉米親本具有區域選擇差異。比較兩種聚類分析結果發現, 兩者均能將大多數南方品種聚集在一起, 但農藝及品質性狀還能將黃淮海、西北品種聚在一起。究其原因為這兩種分析方法是青貯玉米品種遺傳多樣性在不同層面上的體現, 形態學聚類方法是依據作物的表型性狀來區分不同品種間的遺傳差異, 然而表型性狀易受很多復雜因素影響如標記數量少、人為測量誤差、環境條件等, 造成遺傳表達不穩定或不同基因型的品種表現出相同表型特征的結果。相比之下, 分子標記是從DNA水平上反映不同個體間的遺傳變異現象, 不受外界環境影響, 結果相對準確。因此, 農藝及品質性狀與分子標記的分析結果不完全一致是合理的, 將兩類方法相結合能夠更加準確、全面的了解物種的遺傳變異并描述和解釋其遺傳背景。

本文利用農藝及品質性狀與SSR標記評價了我國4個生態區青貯玉米品種的遺傳多樣性, 了解了各生態區品種的農藝、品質性狀及遺傳分化情況,其結果對不同生態區的育種策略調整具有參考價值,但僅從生態區角度對我國主要生產利用的青貯玉米品種進行了分析評價, 今后還有待從統一田間試驗方面對品種進行更深層次了解, 以期更加客觀評價不同品種間形態差異, 為優質品種推廣種植提供科學依據。

4 結論

通過利用農藝、品質性狀和SSR標記分析141個國審和各省區(市)青貯玉米品種的遺傳多樣性,發現我國青貯玉米品種存在豐富的遺傳多樣性, 尤其是西北和南方品種出現明顯的性狀分化現象; 南方品種在農藝及品質性狀和分子遺傳上均具有特異性, 西北和黃淮海品種在農藝及品質性狀上具有特異性; 綜合兩類方法能更準確、全面揭示品種遺傳多樣性, 其研究結果對不同生態區育種策略調整具有一定參考價值。