花生全基因組抗病基因鑒定及其對青枯菌侵染的響應分析

張 歡 羅懷勇 李威濤 郭建斌 陳偉剛 周小靜 黃 莉 劉 念 晏立英 雷 永 廖伯壽 姜慧芳

中國農業科學院油料作物研究所 / 農業農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062

植物抵抗外界微生物刺激而形成的系統稱為植物固有免疫系統, 可分為2個層次。第1個層次是植物模式識別受體(pattern-recognition receptors,P R R S)識別病原相關的分子模式(p a t h o g e nassociated molecular patterns, PAMPs)觸發免疫反應(PAMP-triggered immunity, PTI); 第2個層次是病原菌產生效應物抑制對PTI的基本免疫反應, 而植物抗病基因(resistance gene,Rgene)通過編碼靶向抗性蛋白直接或間接識別病原菌, 進而誘導效應器觸發免疫(effector-triggered immunity, ETI)重建植物的抗性[1-2]。

目前植物中已經克隆了150多個抗病基因[3], 編碼的蛋白質具有共同的結構域, 如卷曲螺旋(coiled coil, CC)、核苷酸結合區(nucleotide binding site,NBS)、Toll-白細胞介素區(toll-interleukin-1 receptor,TIR)、富含亮氨酸重復區(leucine-rich repeat, LRR)、激酶結構域(kinase, KIN) 和跨膜結構域(transmembrane domain, TM)。胞質NBS-LRR基因分為2類:TNL (TIR-NBS-LRR)和CNL (CC-NBS-LRR), 分別擁有TIR或CC結構域[4]。如過表達TNL型抗病基因GmKR3增強大豆對多種病毒的抗性[5], 棉花GhTNL1抗病基因的表達減緩植物葉片黃化、萎蔫現象[6], 番茄CNL型抗細菌性斑點病基因SlNBRP1過表達增加其植株抗病性[7], 水稻中NL型Pi9抗病基因組成型表達抗稻瘟病[8]。包含Kinase和LRR結構域的跨膜受體蛋白, 如受體樣蛋白(RLP)和受體樣激酶(RLK)也參與其中。RLK型基因SlDALR1正調控番茄對Pst DC3000的抗性[9], RLP型基因TaRLP1.1參與小麥對小麥銹病的防御反應[10]。

花生是世界上重要的油料和經濟作物, 廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區。中國是世界最大的花生生產國, 也是最大的花生消費國。據國家統計局統計,2019年中國花生產量1751.96萬噸, 占世界產量近40%。青枯病是我國花生的主要病害之一, 是由茄科雷爾式菌侵染引起的一種細菌性土傳病害, 由于防治困難, 嚴重影響我國花生的品質和產量[11]。培育和種植抗青枯病花生品種是防治青枯病危害最為經濟有效的途徑。目前, 已獲得的抗青枯病基因有: 擬南芥抗青枯病基因RRS1和ERECTA[12-13], 辣椒抗青枯病基因CaLRR-RLK1和CaLRR51[14-15], 花生中參與青枯病響應的基因AhRLK1和AhRRS5[16-17], 對于花生抗病基因的獲得還需要開展更多的研究。

四倍體花生全基因組測序已在2019年完成[18-19],為在全基因組水平研究花生抗病基因提供便利。目前尚沒有關于花生全基因組抗病基因鑒定的相關研究, 本研究利用生物信息學分析鑒定了花生全基因組抗病基因數量及染色體分布, 結合抗、感病品種接種青枯病菌后轉錄組分析, 鑒定了與青枯病抗性有關的差異表達抗病基因, 旨在為克隆花生抗病基因以及抗病分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 花生材料和青枯病菌株

花生抗病品種遠雜9102和感病品種徐州68-4由中國農業科學院油料作物研究所花生遺傳育種團隊提供。青枯病菌為茄科雷爾式菌(Ralstonia solanacearum)生理小種1, 生化型III, 分離自紅安病害苗圃試驗基地[20]。

1.2 R基因的篩選和分類

根據植物抗病基因數據庫(PRGdb; http://prgdb.org/), 利用基因所包含的保守結構域CC、TIR、NBS、LRR、TM和Kinase對花生全基因組進行抗病基因的篩選和分類, 將抗病候選基因分為CK、CT、CL、CLK、CN、CNL、CNT、CTNL、T、TN、TNL、TRAN、L、N、NL、KIN、RLK、RLP共18個類別。

1.3 染色體分布

從花生數據庫(https://www.peanutbase.org/)下載花生品種Tifrunner基因組1.0版本, 利用軟件TBtools提取抗病候選基因的染色體位置信息,MapChart軟件繪制出抗病候選基因在染色體上的分布圖。

1.4 花生材料接種青枯病菌和取樣

參照Chen等[21]使用的方法進行青枯菌培養、花生幼苗培養及接種。接種后12、24、48、72、96 h分別對花生主根部位取樣, 處理組標記為RT12/ST12、RT24/ST24、RT48/ST48、RT72/ST72和RT96/ST96, 對照組標記為RC12/SC12、RC24/SC24、RC48/SC48、RC72/SC72和RC96/SC96。試驗設3次重復, 樣品立即冷凍于液氮中, 并在–80℃下保存。由武漢菲沙基因信息有限公司完成轉錄組測序。

利用RSEM[22], 調用Bowtie2軟件的比對結果進行統計, 得到每個樣品比對到每個轉錄本上的Reads數目, 并對其進行FPKM[23](Fragments Per Kilobase per Million bases)轉換。根據抗感材料對照組和處理組(RC/RT/SC/ST)各時間點的3個生物學重復FPKM均值大于1, 將抗病基因的表達情況分為抗感病材料中均表達、僅在抗病材料中表達、僅在感病材料中表達、抗感病材料中均不表達4類。使用DESeq2[24]對5個時間點RT-vs-RC、RT-vs-ST和RT-vs-SC三個組分別進行差異表達分析, 篩選閾值為FDR (false discovery rate) < 0.05, log2FC (fold change (condition 2/condition 1) for a gene) >1或log2FC < –1。使用TBtools對RT-vs-RC、RT-vs-ST和RT-vs-SC 3個組差異表達上調的R基因各個時間點作韋恩分析, 篩選出的差異表達基因使用Microsoft Excel作折線圖和RStudio[25]制作熱圖。

1.5 抗病基因qRT-PCR分析

以RNA-seq測序的根組織RNA為模板, 采用諾唯贊HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒, 反轉錄合成cDNA。用Primer 5.0軟件設計引物, 采用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR試驗, 反應體系(20 μL)包含2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol L–1) 各0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反應程序為95℃預變性30 s, 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 72°C延伸20 s, 40個循環。每個反應進行3次重復, 花生內參基因Actin的引物為actin-F: 5′-TAAGAACAATGTTGCCATACAGA-3′,actin-R: 5′-GTTGCCTTGGATTATGAGC-3′。按 照2?ΔΔCT計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 花生R基因的鑒定和染色體分布

在花生Tifrunner參考基因組[18]中共篩選得到4156個抗病候選基因, 分為TNL、CNL、RLK、RLP等18個類別(表1)。在典型的5類抗病基因中, 基因數目較多的是RLK型(536個)和RLP型(490個), 占總抗病候選基因數目的12.90%和11.79%, 其次是NL型(232個)和CNL類抗病基因(182個), 占抗病候選基因總數的5.58%和4.38%, TNL型抗病基因(149個)占抗病候選基因總數的3.59%。非典型的13個抗病類型中, 僅含Kinase保守結構域的KIN型抗病候選基因數目為1714個, 占總抗病候選基因數目的41.24%; 其余12個類別候選基因含有NBS/CC/TIR/TM/LRR/Kinase等保守結構域的不同組合形式, 占比0.05%~5.32%,共853個。抗病候選基因分布于花生20條染色體上(圖1), 在染色體B02上的抗病基因數量最多, 為334個, A01和A06上抗病基因數量最少, 為137個。

表1 花生R基因的數量和分類Table 1 Number and type of R genes in peanut

2.2 抗病候選基因對青枯病侵染的響應

在接種青枯菌后5個時間點中, 抗病材料遠雜9102對照組(RC)共2383個抗病候選基因表達, 處理組(RT)有2337個表達; 在感病材料徐州68-4對照組(SC)共2304個候選基因表達, 處理組(ST)有2325個表達。抗感材料中表達的抗病候選基因數目基本一致。抗病材料(RC+RT)中特異表達的基因有111個,感病材料(SC+ST)中特異表達的有104個, 抗病、感病材料均有表達的基因2216個, 抗、感病材料中均不表達的有1725個。根據FPKM值將所有抗病基因分為5組(圖2), 從圖2可看出, FPKM值在1~5的抗病候選基因數量最多, 占總表達基因數目的42.6%~46.8%; FPKM值在50以上最少, 基因數量在1.8%~2.3%, 植物體內大部分的抗病基因轉錄水平較低。

2.3 差異表達R基因的鑒定

在接種青枯菌12 h的樣品中, 通過對RT12-vs-RC12、RT12-vs-ST12和RT12-vs-SC12 3個組差異表達基因的分析, 鑒定出2類差異表達R基因: 第1類是3個在抗病材料接種青枯菌后誘導表達的基因,在RT12的表達量顯著高于RC12、ST12和SC12, 推測其受到青枯菌侵染的誘導表達(圖3-a~c); 第2類是33個在抗病材料中持續上調表達的差異基因, 在RT12和RC12中的表達量差異不顯著, 但是顯著高于ST12和SC12 (圖3-f)。通過類似的方法, 在接種青枯菌24、48、72和96 h后, 鑒定到第1類差異表達R基因分別有1、0、1和0個(圖3-d, e); 第2類差異表達R基因有42、41、39和28個, 在抗病材料中差異不顯著, 但顯著高于感病材料(圖3-g~j)。

綜合所有時間點, 第1類差異表達R基因只在對應的時間點特異上調表達。但是在第2類差異上調的65個抗病候選基因中, 有27個R基因在4個時間點及以上差異表達, 在5個時間點連續差異上調表達的R基因11個, 有9個R基因在12~72 h連續差異上調表達, 3個R基因在24~96 h連續差異上調表達, 在12、24、72、96 h差異上調表達的R基因2個, 在12、24、48、96 h差異上調表達1個, 12、48、72、96 h差異上調表達1個(圖3-k)。

2.4 抗青枯病QTL區間候選基因表達差異分析及qRT-PCR驗證

前期在遠雜9102和徐州68-4構建的RIL群體中, 通過QTL分析鑒定到1個主效抗青枯病QTLqBWRB02.1[26]。通過對其候選區間分子標記的比對發現, 該QTL位于Tifrunner B02染色體4.05~6.12 Mb區間內, 該區間包含13個抗病候選基因, 其中6個候選基因在接種青枯菌后表達, 7個不表達。在表達的6個基因中, 有3個包含在上述鑒定到的第2類差異表達基因中, 其表達情況如圖4-a所示。針對Arahy.5D95TJ設計了特異熒光定量引物, F:5′-TGCAAGGTACAATAAGGAGACAGG-3′, R: 5′-AATACTAGCCTCCAATAAGCATCC-3′。qRT-PCR結果顯示該基因的表達趨勢(圖4-b)與轉錄組測序結果(圖4-c)基本一致。

3 討論

抗病基因在植物抵抗細菌、真菌、病毒等病原體過程具有非常重要的作用[27]。本研究根據保守結構域在花生參考基因組中鑒定出4156個抗病候選基因, 將其分為18類抗病分型。豆科植物木豆、菜豆、大豆中分別鑒定到289、337和465個NBS-LRR類抗病基因[28], 各占全基因組基因數目的0.5%、1.1%和1.9%[29-31]。本研究發現, 典型抗病基因NBS-LRR類641個, 占花生全基因組數目的0.8%, 推測抗病基因數目與基因組大小沒有直接的聯系。

單子葉植物谷子、玉米、水稻各有NBS-LRR類家族基因數目為411、21和545個, 但是沒有發現TNL型抗病基因[32-34]。在雙子葉植物三裂葉薯、黑籽南瓜、番茄、葡萄、鷹嘴豆中CNL型抗病基因數目大于TNL型[35-39], 而向日葵、大豆、擬南芥等植物中TNL型抗病基因數目大于CNL型[40-42], 本研究鑒定出花生抗病基因CNL型182個, TNL型149個(CNL/TNL約1.2倍), 這說明雙子葉植物中CNL型和TNL型抗病基因可能有不同的進化模式。

在植物中, RLK和RLP富含植物激素信號和植物病原菌互作途徑[43], RLK類抗病基因作為脅迫表達相關基因的一部分參與植物體應答逆境和與防御相關的過程[44], 在4種棉屬植物中鑒定出1641個RLK基因[45], 在馬鈴薯、蘿卜、苜蓿和二穗短柄草中分別鑒定出479個[46]、292個[47]、329個[48]和268個[49]PLK基因, 本研究在花生全基因組中篩選鑒定得到RLK型抗病基因536個。總共有82個RLP基因在楊樹基因組中被鑒別出來[50], 在普通煙草中共鑒定出70個RLP基因[51], 本研究在花生全基因組中篩選鑒定得到RLP型490個, 這些基因可能參與應答青枯菌誘導的防御反應。

抗病基因在染色體上的分布不均勻。如NBS-LRR類抗病基因在甘薯13號染色體有54個而11號染色體僅有3個[52]; 同樣的, 番茄中NBS類抗病基因在4號染色體所含數目最多[37]。花生為雜交起源的異源四倍體作物, 包含來自2個祖先物種的全部染色體組, 抗病基因在B組染色體上數目大于A組染色體, 并且花生染色體B02上抗病基因數目最多。

已有研究表明, 花生中AhRRS5[16]和AhRLK1[17]基因在煙草中過表達顯著增加了對青枯菌的抗性, 分別下載CDS序列并比對到花生Tifrunner參考基因組[18], 結果顯示最高同源序列為染色體B05上Arahy.WIN0ZV基因和A03上Arahy.8BA7G9基因,將其鑒定為CNL型和RLK型抗病基因。本研究篩選到2類差異表達的抗病候選基因, 第1類是5個在抗病材料接種青枯菌后差異表達高于抗病對照以及感病材料, 推測這些基因是受到青枯菌誘導后上調表達, 初步判定與花生的抗青枯病特性相關; 第2類, 有65個在抗病材料中持續上調表達的差異基因,這一類基因在接種青枯菌前后, 抗病材料遠雜9102中的表達量始終高于感病材料徐州68-4, 其中有27個抗病候選基因在4個時間點以上連續差異上調表達。這2類差異表達基因含11種抗病類別, 基因數目從多到少為NL (14)、N (9)、KIN (8)、RLP (7)、CN (7)、CTNL (6)、RLK (4)、CNL (4)、CK (4)、TNL (2)和TN (2)。本研究還驗證了花生青枯病QTL區間的抗病候選基因Arahy.5D95TJ屬于第2類持續上調表達抗病基因N型, 在抗病材料遠雜9102中4個時間點連續表達。通過Interproscan分析發現, 該基因可能包含與已克隆抗病基因不同的CC和LRR結構域,推測Arahy.5D95TJ可能與AhRRS5具有相同的靶向位點, 通過相同或相似的信號通路來參與對青枯菌的防御反應。本研究結果可為開展花生青枯病抗病基因的克隆和功能驗證, 以及解析花生響應青枯菌脅迫的抗性應答機制提供參考。

4 結論

發掘候選抗病基因4156個, 在染色體上呈不均勻分布; 得到差異表達的5個響應青枯菌誘導型和65個持續上調表達抗病候選基因, 驗證了一個持續上調表達抗病候選基因Arahy.5D95TJ。研究結果可為花生抗病基因的克隆、鑒定及其抗病育種奠定基礎。