靶向于Galectin-10蛋白的哮喘抑制劑設計

李南星，張麟

（天津大學化工學院，天津 300350）

引言

哮喘是一種慢性支氣管疾病[1]。其發生是由于先天和適應性免疫系統細胞與上皮細胞共同作用，導致支氣管超反應性(哮喘患者平滑肌細胞對冷空氣和運動等非特異性刺激的反應趨勢)、黏液分泌過多、氣道壁重塑和氣道狹窄[2]。在易感患者中，會反復出現呼吸短促、喘息和胸悶等癥狀[1,3]。目前全球哮喘患者約有3億[1-2,4]，每年有25萬～35萬人死于哮喘[5-6]，導致對哮喘疾病的大量醫療支出。該病在發達國家成人中的發病率約為10%[3]。哮喘疾病已經對世界經濟和社會發展造成極大負面影響，是人類社會面臨的一個健康難題和挑戰。

嗜酸性粒細胞炎癥是哮喘中主要的炎癥類型，由其導致的哮喘約占全部嚴重哮喘的40%～60%[6-8]。1853 年，Charcot 報道了哮喘患者氣道中的細胞外雙錐體晶體，Leyden 在1872 年也有類似報道[9]，該晶體后被命名為Charcot-Leyden 晶體(CLCs)。在慢性鼻竇炎、寄生蟲感染和伴有組織嗜酸性粒細胞的癌癥中也觀察到類似的晶體[10-11]。CLCs是嗜酸性粒細胞死亡的一個標志，可以在組織中存活數月。CLCs 由人類嗜酸性細胞中最豐富的蛋白質之一Galectin-10(Gal10)組成[12]。Gal10 從活化的嗜酸性粒細胞的細胞質中被釋放出來，經歷相變成為晶體進而引發哮喘疾病。已有研究表明，使用Gal10晶體誘導動物免疫反應可以產生抗體，抗體可以快速溶解患者黏液中大量存在的CLCs，在臨床前模型中解決CLC 晶體病變的關鍵特征，研究認為抗體結合在Gal10 晶體的關鍵表位Y69 處介導晶體堆積作用導致晶體溶解，定點突變Gal10 蛋白的Y69 確可使得Gal10蛋白不再結晶[13]。

目前臨床上治療哮喘大多基于疾病嚴重程度使用經驗方法，而不是基于潛在的發病機制。通常使用擴張支氣管和抗炎抗過敏藥物[14-16]來緩解癥狀。單克隆抗體藥物[17-20]雖然靶向于一些致病靶點，但其治療成本非常高。因此，針對嗜酸性粒細胞性炎癥哮喘，解析Gal10 蛋白結晶或溶解中涉及的關鍵作用位點和相互作用分子細節，由此設計多肽抑制劑以抑制哮喘，具有重要研究意義。

本課題組前期已經基于蛋白質表界面研究[21]，設計開發靶向于膠原蛋白的血栓抑制劑[22-26]、病毒樣顆粒配基[27-28]、埃博拉病毒中和配體[29]等。本文沿用蛋白質表界面分析流程，利用分子動力學模擬和結合自由能分析方法確定Gal10 蛋白與抗體結合作用的關鍵位點和相互作用分子細節，通過構建親和模型、建立多肽抑制劑庫以篩選確定高效的哮喘抑制劑。

1 實驗模型和方法

1.1 模型

哮喘溶晶抗體1D11 與Gal10 蛋白結合的晶體結構來源于Protein Data Bank(PDB ID 6GLW，http://www.rcsb.org/pdb/)[13]，采 用GROMOS96 43a1力場。模擬環境為生理鹽水溶液并通過反離子平衡系統凈電荷，其中水分子采用SPC/E 模型。模擬體系的盒子尺寸為13 nm×13 nm×9 nm，包含46989 個水分子、137個鈉離子和139個氯離子。

1.2 分子動力學模擬

采用GROMACS 5.1.4[30](http://www.gromacs.org/)進行50 ns 正則(NVT)系綜分子動力學(molecular dynamics，MD)模擬。系統溫度通過velocity-rescale(v-rescale)[31]方法維持在310.15 K。使用LINCS[32](Linear Constraint Solver)算法限制共價鍵和鍵角的震動。使用三維周期性邊界條件。靜電相互作用通過PME[33](Particle-mesh Ewald)算法處理。相鄰原子截斷距離、庫侖截斷距離以及LJ(Lennard-Jones)勢能截斷距離都設定為1.2 nm。粒子初始速度根據310.15 K 溫度下的Maxwell 分布獲得。模擬采用Verlet 算法，積分步長設定為2 fs。各體系于模擬開始前都經歷能量最小化。模擬過程至少重復三次。

1.3 結合自由能分析

通過分子力學-泊松-玻爾茲曼方程-表面積(MM-PBSA)[34]自由能分析方法和g_mmpbsa[35]程序解析溶晶抗體1D11與Gal10蛋白的結合自由能(ΔGbind)以及結合界面的關鍵氨基酸位點。結合自由能根據如下方程進行計算，從每次模擬的50 ns軌跡中以100 ps為間隔提取500個軌跡進行分析。

式中，ΔGbind是結合自由能；ΔGpolar是極性自由能；ΔGnonpolar是非極性自由能；ΔGelec是靜電相互自由能；ΔGPB是靜電溶劑化效應產生的自由能；ΔGvdW是范德華相互自由能；ΔGSASA是非極性溶劑化效應產生的自由能。

1.4 多肽抑制劑的親和模型及肽庫構建

基于MM-PBSA 自由能解析獲得的溶晶抗體1D11中與Gal10蛋白結合關鍵位點信息構建親和模型，結合空間方位確定抑制劑序列，利用自編腳本生成多肽抑制劑庫。

1.5 多肽抑制劑的分子對接篩選

利用分子對接、多肽抑制劑構象分析進行抑制劑篩選。分子對接以Gal10 蛋白作為受體，多肽抑制劑作為配體，采用AUTODOCK VINA 1.1.2[36](http://vina.scripps.edu/)進行分子對接。通過打分(EVINA)評估結合作用，根據打分分布情況選擇多肽抑制劑進行后續篩選。

利用GROMACS 程序計算多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 中關鍵殘基間的均方根偏差(root-meansquare deviation，RMSD)。篩選RMSD≤0.5 nm 的多肽抑制劑進行后續篩選。

1.6 多肽抑制劑與Gal10 蛋白作用的分子動力學模擬

在通過對接結構分析評估多肽抑制劑與Gal10蛋白間結合結構基礎上，利用MD 模擬研究結合的動態過程及其微觀相互作用。MD模擬設置同1.2節所述。使用editconf 命令將多肽抑制劑與Gal10 蛋白的最小距離調整為1.5 nm，并選擇未調整距離的結合復合物作為對照，分別為Sep體系和Com體系。

1.7 多肽抑制劑抑制效果驗證

通過Gal10蛋白-溶晶抗體-多肽抑制劑三元體系的MD 模擬，研究多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 同時存在情況下抑制劑與Gal10 蛋白的結合情況，以評估多肽抑制劑的抑制效果。采用NVT 系綜模擬，計算RMSD 和回轉半徑(radius of gyration,Rg)評估分子構象變化，計算分子間最小距離dmin、質心距離dcom、LJ 勢能(ELJ)、Coulomb 勢能(EC)評估分子間結合過程。

2 實驗結果與討論

2.1 蛋白復合物的分子行為

通過50 ns MD 模擬考察Gal10 蛋白與溶晶抗體1D11 在生理鹽水中的分子行為，如圖1 所示。結果顯示，模擬過程中蛋白與抗體間的最小距離dmin基本保持在0.17 nm，表明復合物的結構穩定。Coulomb勢能和LJ勢能為負值，表明靜電作用和疏水相互作用驅動蛋白與抗體間結合。相對于溶晶抗體，Gal10蛋白的RMSD 值更小，表明Gal10 蛋白分子結構較穩定而溶晶抗體結構相對易變。蛋白與抗體的Rg值隨模擬變化都較小，表明二者結構緊密。

圖1 Gal10蛋白與溶晶抗體1D11間相互作用分析Fig.1 Molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.2 結合自由能解析

通過MM-PBSA 自由能分解計算溶晶抗體1D11與Gal10 蛋白的結合自由能。ΔGelec=-231 kcal·mol-1（1 cal=4.18 J），ΔGvdW=-75 kcal·mol-1，ΔGSASA=-7 kcal·mol-1，表明靜電相互作用、范德華相互作用及非極性溶劑化效應均對結合起有利作用。ΔGPB=247 kcal·mol-1，表明靜電溶劑化效應對結合起不利作用。根據1.3節所述自由能計算方程，ΔGpolar=16 kcal·mol-1，ΔGnonpolar=-82 kcal·mol-1，最終結合自由能ΔGbind=-66 kcal·mol-1，表明疏水相互作用促進結合，考慮溶劑效應后靜電相互作用對結合不利，因而二者結合主要由疏水相互作用驅動。

計算結合界面上各氨基酸殘基的結合自由能，如圖2 所示。確定Gal10 蛋白的Y69、K117、D113、E68、I116、H114，溶晶抗體1D11 的W53-H、Y104-H、N97-L、K55-L、Y93-L、R100-H 對結合比較有利，其中W53-H為疏水氨基酸殘基。對結合不利的主要為帶電氨基酸殘基，如Gal10 蛋白中的K73、R115、E119 及溶晶抗體1D11 中的E52-L、D99-H。綜合前述結合自由能分析，確認疏水作用是Gal10蛋白和溶晶抗體1D11結合的主要驅動力，同時也證實Y69 在蛋白與抗體結合過程確有關鍵作用，與文獻報道[13]結果相符。

圖2 Gal10蛋白與溶晶抗體1D11的相互作用界面分析Fig.2 Molecular interface between Gal10 protein and antibody 1D11

2.3 親和模型的構建與多肽抑制劑庫的建立

以溶晶抗體1D11 關鍵作用位點為基礎構建親和模型并建立多肽抑制劑庫，綜合考慮位點距離和自由能貢獻大小，選取W53-H、Y104-H、N97-L、Y93-L 構建親和模型，如圖3 所示。結合空間方位設計得到多肽抑制劑特征序列WXYXXNXY(其中X代表20 種常見氨基酸的任意一種)。利用自編腳本生成多肽抑制劑庫，保證抑制劑庫內的序列多樣性及構象多樣性。

圖3 基于Gal10蛋白與溶晶抗體1D11相互作用的抑制劑設計Fig.3 Design of inhibitors based on the molecular interactions between Gal10 protein and antibody 1D11

2.4 多肽抑制劑的分子模擬篩選

利用AUTODOCK VINA 將多肽抑制劑與Gal10蛋白依次進行對接。對接結果顯示多肽抑制劑結合打分(EVINA)分布在-8.3～-3.6 kcal/mol 范圍內，表明所有多肽抑制劑都能與Gal10 蛋白自發結合，但由于多肽抑制劑序列和構象的差異而表現出對Gal10蛋白不同的親和力。根據多肽抑制劑結合打分分布情況，綜合考慮后續篩選步驟，確定以結合自由能≤-7.5 kcal/mol 為標準，獲得209 個多肽抑制劑進行后續篩選。

利用GROMACS 程序計算多肽抑制劑與溶晶抗體1D11 關鍵殘基間的RMSD 值，以確定二者結構相似性，即考察抑制劑模擬溶晶抗體1D11 關鍵位點的效果。結果顯示，RMSD 值分布在0.3～1 nm范圍內。以RMSD≤0.5nm 為標準，獲得17 個多肽抑制劑進行后續篩選。利用VMD 軟件進行構象比對和結合位點分析，結果最好的10 個多肽抑制劑如圖4所示。

圖4 溶晶抗體1D11關鍵殘基與多肽抑制劑的構象比對Fig.4 Conformational comparison between the key residues of the antibody 1D11 and polypeptide inhibitors

2.5 多肽抑制劑與Gal10的分子動力學模擬

結合對接結果EVINA、結構相似性分析RMSD 及構象比對結果，選取6個多肽抑制劑進行后續MD模擬驗證，具體信息如表1所示。

表1 抑制劑篩選結果Table 1 Results of inhibitor screening

多肽抑制劑與Gal10 蛋白的結合情況如圖5 所示。在生理鹽水環境下，Sep 體系中人為分開的WGYGWNGY和Gal10蛋白間，最小距離經歷3 ns左右的波動后達到穩定波動，質心距離逐漸變小并在4 ns左右達到穩定波動，表明抑制劑能夠和Gal10蛋白結合迅速且穩定。Sep 體系中的WGYGWNGY 的RMSD 值略大于Com 體系，表明結合過程中抑制劑存在結構變化。能量分析顯示，Gal10 蛋白和WGYGWNGY 間的Coulomb 勢能和LJ 勢能從2 ns 左右開始減小，且隨著多肽抑制劑結構逐步穩定，Coulomb 勢能和LJ 勢能的變化也趨于穩定，能量變化趨勢和大小與Com 體系基本一致，確證其穩定結合。軌跡中截取構象表明WGYGWNGY 結合在Gal10蛋白的關鍵位點附近。

圖5 Gal10蛋白與WGYGWNGY相互作用情況Fig.5 Molecular interactions between Gal10 protein and WGYGWNGY

2.6 多肽抑制劑抑制效果驗證

對Gal10蛋白-溶晶抗體-多肽抑制劑三元體系進行MD 模擬，結果如圖6 所示。WGYGWNGY 與Gal10蛋白間的最小距離在5 ns內降低至0.1 nm，質心距離同步降低至2 nm，后續呈現穩定波動，相互作用勢能也在4 ns 左右開始降低，表明WGYGWNGY快速結合到Gal10 蛋白表面。在WGYGWNGY 與Gal10蛋白結合期間，溶晶抗體1D11逐漸遠離Gal10蛋白，且相互作用勢能始終為0，表明WGYGWNGY競爭性結合Gal10 蛋白，結合效果優于溶晶抗體1D11。因此，WGYGWNGY被認為是與Gal10蛋白具有高親和力的溶晶抗體1D11仿生多肽抑制劑。

圖6 Gal10蛋白、WGYGWNGY與溶晶抗體1D11相互作用情況Fig.6 Molecular interactions of Gal10 protein,WGYGWNGY and antibody 1D11

3 結論

(1)通過MD 模擬和MM-PBSA 自由能解析溶晶抗體1D11 和Gal10 蛋白的相互作用細節，確定二者結合的關鍵氨基酸殘基并藉此構建多肽抑制劑親和模型，特征序列為WXYXXNXY(X 代表20 種常見氨基酸的任意一種)，通過氨基酸定位方法建立多肽抑制劑庫。

(2)在分子對接篩選、RMSD比較、構象比對分析中，WGYGWNGY抑制劑EVINA=-7.8 kcal·mol-1，RMSD值為0.49 nm，構象比對顯示結合位點準確且構象與溶晶抗體1D11 關鍵位點相似，表現出與Gal10 蛋白較好親和力。

(3)在MD模擬及抑制效果驗證中，WGYGWNGY均能在短時間內結合在Gal10 蛋白關鍵位點處，結合情況穩定。因此WGYGWNGY 是具有高親和性的多肽抑制劑，并為后續開發新型哮喘治療藥物奠定了基礎。