新型金雀異黃素衍生物抑制骨肉瘤MG-63細胞遷移和侵襲的作用及機制

趙學正　　高偉　　唐保永　　鄭思化　　李利軍

[關鍵詞] 5-羥基-4'-硝基-7-丙酰氧基金雀異黃素;增殖;遷移;侵襲;凋亡

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）16-0037-06

Effects and mechanisms of novel genistein derivatives in inhibiting the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells

ZHAO Xuezheng? ?GAO Wei? ?TANG Baoyong? ?ZHENG Sihua? ?LI Lijun

Department of Orthopedics， Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou? ?310023， China

[Abstract] Objective To detect the inhibitory effect of novel genistein derivatives HNPG on the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells and its possible molecular biological mechanism. Methods Osteosarcoma MG-63 cells were cultured in vitro，and MTT was used to detect the proliferation inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The scratch test was used to detect the migration inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The Transwell was used to detect the inhibitory effect of the invasion of HNPG on MG-63 cells. PI staining FCM was used to detect the blocking effect of HNPG on the G1 phase of MG-63 cells. AV-PI staining FCM was used to detect the apoptosis induction effect of HNPG on MG-63 cells. Western blotting was used to detect the regulatory effect of HNPG on the expression of p53，bcl-2， and bax proteins in MG-63 cells. Results HNPG inhibited the proliferation of MG-63 cells in a time and concentration-dependent manner in vitro. The IC50 of 24 h was（4.8±0.6） μmol/L. The 24 h proliferation inhibition rate of MG-63 cells treated by 5 μmol/L of HNPG was（45.2±4.6）%， which was higher than that of（0.40±0.02）% in the NS group， the difference was significant （P<0.05）. The scratch healing rate was（38.24±2.48）%， which was lower than that of （71.23±4.62）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The invasion inhibition rate was（44.66±2.06）%，which was higher than that of （0.34±0.03）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The proportion of cells in the G1 phase （78.65±3.48）%， which was higher than that of （64.40±2.02）% in the NS group，the difference was significant （P<0.05）. The apoptosis rate was increased more statistically（24.63±2.12）%， which was higher than that of （2.75±0.20）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. At the same time the expression of p53 and bax protein was up-regulated， while the expression of bcl-2 protein was down-regulated，which was statistically significant compared with the NS group（P<0.05）. Conclusion HNPG can significantly inhibit the proliferation， migration， and invasion of MG-63 cells in vitro，and its mechanism may be that it blocks cells in G1 phase， up-regulates the expression of p53 protein， activates the expression of bax protein， inhibits the expression of bcl-2 protein， and induces apoptosis.

[Key words] 5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxygenistein; Proliferation; Migration; Invasion; Apoptosis

化療在骨肉瘤治療方面有著極其重要的作用，術后化療和新輔助化療的臨床應用極大改善了骨肉瘤患者預后，因此開發新型化療藥物便成為腫瘤工作者的靶向之一[1]。既往文獻報道，金雀異黃素具有抗腫瘤等作用，然而溶解度差、生物利用度小限制了其臨床應用[2]，而通過基因修飾可以提高GEN的溶解性和生物利用度，增加抗腫瘤活性，新型金雀異黃素衍生物（5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxy-genistein，HNPG）是在金雀異黃素母核C-4'引進硝基、C-7引進丙酰氧基的新型衍生物，具有抗腫瘤活性[3]，然而其對骨腫瘤的生物作用尚未進行報道。本研究通過檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞活性的抑制作用，探討其可能的細胞通路，為HNPG的抗腫瘤應用提供理論指導和實驗數據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 骨肉瘤MG-63細胞體外培養和實驗耗材

人骨肉瘤MG-63細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，對數生長期的MG-63細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，細胞培養箱溫度為37℃，濕度為飽和濕度內含5%CO2。HNPG（分子式：C18H13O7N，分子量：355，色澤：淺黃色，性狀：粉末，純度：98%）由海軍軍醫大學金永生教授惠贈。一抗p53（BM4206）、bcl-2（A00040-1）、bax（A00183）和GAPDH（A00227-1）購自BOSTER生物技術有限公司。MTT（C0009）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）（C0022）、胰蛋白消化酶（C0205）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（C0162）購自Beyotime生物技術研究所。細胞裂解液（ARAR0107）和標準胎牛血清（PYG0001）購自BOSTER生物技術有限公司。

1.2 MTT法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率

取96孔細胞培養板，以密度5000個/孔接種MG-63細胞，培養24 h待其貼壁，然后每孔添加HNPG使其終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L，待HNPG作用細胞24 h后，采用酶標儀檢測HNPG對MG-63細胞的增殖抑制率，獲取HNPG抑制MG-63細胞增殖的最佳濃度用于后續實驗。取DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（5、10、20 μmol/L）培養24 h，棄去細胞培養基，更換新的細胞培養基，添加 MTT使其終濃度為5 mg/L，作用MG-63細胞4 h，棄去含MTT的細胞培養基，每孔添加100 μL DMSO，靜置10 min，上酶標儀（型號：ELX-800 type）檢測MG-63細胞結晶紫光密度，發射光波長為570 nm。細胞增殖抑制率公式：IR=（1-λ實驗組/λ空白對照組）×100%，按改良寇氏法求出IC50[4]。以上實驗重復3次。

1.3劃痕實驗檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞遷移的影響

取對數期生長的MG-63細胞，培養24 h后完全貼壁后，更換培養基，PBS沖洗2遍，用200 μL無菌槍頭在孔內輕輕地劃1～3道痕，再用PBS沖洗去掉脫落的細胞，倒置顯微鏡下拍照。隨后添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后繼續培養24 h，棄去培養基，用PBS清洗2遍，95%酒精固定，隨意選取3個不同位置，在倒置顯微鏡下拍照（×100），并采用Image J軟件測量劃痕寬度，計算平均值，以劃痕愈合率代表細胞的遷移能力，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%[5]。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。

1.4 Transwell法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞侵襲的影響

取預冷24 h的24孔Transwell培養板，將30 μL MatrigelTM人工基質膠（無血清培養基按1：3配置），輕柔地鋪在Transwell裝置的上室并靜置3 h。取對數期生長的MG-63細胞200 μL（2×105/mL）置于上室的膠層上，再將上室置于每孔含DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）10%胎牛血清+RPMI 1640培養液500 μL的下室中，于37℃、5%CO2孵育箱中培養24 h，然后用PBS液沖洗膠層，在室溫下用95%甲醇固定15 min，再用結晶紫染色15 min。高倍鏡（200×）下隨機對5個視野的細胞進行連續計數，取均值。侵襲抑制率按如下公式計算：細胞侵襲抑制率（%）=（空白對照組穿膜細胞數-實驗組穿膜細胞數）/空白對照組穿膜細胞數×100%[6]。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。

1.5 FCM法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞周期的影響

取對數期生長的MG-63細胞，培養24 h完全貼壁后，更換培養基，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h，更換細胞培養基，用0.25%的胰酶消化，以2000 rpm離心5 min，棄去上清液，分別用50 mmol/mL的碘化吡啶（PI）溶液1 mL混懸，在暗室于37℃靜置30 min，用DMEM細胞培養液混懸3次，采用流式細胞儀進行檢測，實驗用激發波為488 nm，而實驗用發射波為530 nm[7]。細胞周期檢測重復3次，取細胞周期的平均值進行統計分析。

1.6 FCM法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響

取對數期生長的MG-63細胞，培養24 h完全貼壁后，更換培養基，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）和HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h，棄去培養基，用PBS輕微震蕩洗2遍，然后采用0.25%的胰酶消化MG-63細胞，將消化收集的細胞以2000 rpm轉速離心5 min，棄去上清液，分別用50 mmol/mL的膜聯蛋白V（Annexin-V）和碘化吡啶（PI）溶液1 mL混懸，在暗室于37℃靜置30 min，用DMEM細胞培養液混懸3次，采用流式細胞儀進行檢測，實驗用激發波為488 nm，而實驗用發射波530 nm[8]。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。

1.7 Western blotting法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡相關蛋白表達的影響

取對數期生長的MG-63細胞，培養24 h完全貼壁后，更換培養基，添加不同濃度的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后，繼續培養24 h，用冰PBS輕微震蕩洗MG-63細胞3次，用無菌濾紙條洗干凈殘余PBS液體后，加入PMSF裂解細胞并提取蛋白，取30 μg MG-63細胞蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，再用5%脫脂牛奶-TBST室溫搖床封閉PVDF膜2 h，在37℃條件下用一抗孵育PVDF膜3 h，二抗孵育PVDF膜1 h，ECL激發PVDF膜上熒光，X線片壓片，經顯影定影后，用Imange J 2200軟件分析處理[9]。

1.8 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件對所有實驗數據進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制的影響

取不同濃度的HNPG（0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L）分別作用于骨肉瘤MG-63細胞24 h，發現HNPG對細胞的增殖抑制率隨濃度增加而增加，其中HNPG濃度在1.25～20.00 μmol/L范圍之間抑制作用顯著，不同濃度的HNPG對骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制率與NS組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1A。選取2.5、5.0、10.0 μmol/L的HNPG為研究對象，發現HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制呈時間依賴性，其中5.0、10.0 μmol/L HNPG在12、24、48 h時間段對MG-63細胞的抑制率分別為（21.6±3.2）%、（45.2±4.6）%、（50.4±5.2）%，較NS組的（0.40±0.02）%顯著升高，不同組的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）在12、24、48 h時間段對MG-63細胞的抑制率組間比較，差異有統計學意義（P<0.05），HNPG作用MG-63細胞24 h的IC50為（4.8±0.6）μmol/L;其中5 μmol/L的 HNPG 對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制作用與5 μmol/L DDP（43.8±4.8）%或160 μmol/L GEN（44.2±5.0）%相當，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1B。

2.2 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞遷移的影響

取對數期生長的MG-63細胞，分別經DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h，劃痕愈合率分別為（39.27±3.24）%、（37.84±3.08）%、（52.91±2.64）%、（38.24±2.48）%和（7.26±0.39）%，較NS組的（71.23±4.62）%顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。HNPG各組之間，差異有統計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞劃痕愈合率相當，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖2。

2.3 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞侵襲的影響

取對數期生長的MG-63細胞，分別經DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h，細胞侵襲率分別為（42.72±2.93）%、（48.54±3.17）%、（23.30±1.38）%、（44.66±2.06）%和（87.39±4.05）%，較NS組的（0.34±0.03）%顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。HNPG各濃度組之間兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞侵襲率相當，差異無統計學意義（P>0.05）。見封三圖6。

2.4 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞周期的影響

取對數期生長的MG-63細胞，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h后，FMC檢測發現MG-63細胞G1期比率增高，細胞G1期分別為（79.05±3.24）%、（77.77±4.08）%、（69.23±2.64）%、（78.65±3.48）%和（87.26±4.79）%，較NS組的（64.40±2.02）%顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。HNPG各組之間，差異有統計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞G1期相當，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

2.5 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響

取對數期生長的MG-63細胞，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h后，MG-63細胞凋亡率分別為（22.74±1.52）%、（22.08±1.71）%、（10.41±1.17）%、（24.63± 2.12）%和（34.40±3.16）%，較NS組的（2.75±0.20）%顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。HNPG各濃度組凋亡率之間兩兩進行比較，差異有統計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞凋亡率相當，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

2.6 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白的影響

取對數期生長的MG-63細胞，分別添加不同濃度HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續培養24 h后，提取MG-63細胞蛋白并檢測其平均相對灰度值，結果顯示HNPG各濃度組蛋白表達平均相對灰度值與NS組比較，p53和bax蛋白表達隨濃度增大而增大，差異有統計學意義（P<0.05）。與NS組比較，MG-63細胞bcl-2蛋白表達下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

3 討論

腫瘤細胞的異常增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要表征，腫瘤細胞的異常增殖，致使瘤體組織壓迫、浸潤和侵襲周圍組織的范圍和強度增大，遠處轉移機會增多，釋放入體內的有害物質增多;腫瘤細胞發生遷移，轉移到其他部位，繼續破壞器官組織;同時腫瘤細胞會發生局部浸潤、侵襲，破壞組織結構，嚴重威脅患者的身心健康，因此抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，是腫瘤治療的首要舉措和衡量指標[10-11]。化療是骨腫瘤的重要治療舉措之一，化學藥物不僅可以抑制腫瘤細胞增殖，還可以殺死腫瘤細胞，使患者的無瘤生存期延長，極大改善了患者生活質量[10]。在臨床化療藥物的基礎上，通過改變藥物化學結構，提高藥物的生物吸收度和生物學性狀，增加藥物對腫瘤細胞增殖抑制率是當前的研究熱點[11]。本研究將不同濃度的HNPG作用于對數期生長的骨肉瘤MG-63細胞，結果顯示HNPG在體外對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲有顯著的抑制作用，與其先導化合物GEN及DDP抗腫瘤效果相似[2-3]，提示HNPG作為一種抗腫瘤物質，極具研究價值。

細胞增殖必須依次經過G1、S、G2、M期，同時細胞在增殖過程任何一期進程減慢、停滯、加速均可能引起疾病的發生[12]。細胞周期的進展，受周期素、周期依賴性激酶、周期依賴性激酶抑制因子、細胞周期檢測點等因素的調控[13]。細胞周期檢測點包括DNA損傷檢查點、DNA復制檢查點、染色體分離檢查點和紡錘體組裝檢查點，各檢查點所處的位置和功能各異，其中DNA損傷檢查點備受關注;當位于G1/S交界的DNA損傷檢查點探測和獲得DNA受損的信號后，則由效應器中斷細胞周期進程，將細胞阻滯于G1期，并啟動DNA修復，以保證DNA的質量[14]。凋亡是細胞在誘導凋亡的相關因素作用下，啟動信號轉導，凋亡基因接受死亡信號后按預定程序啟動合成執行凋亡所需的多種酶而引發的一種程序性死亡，凋亡在疾病發生發展中具有積極的意義[15]。本研究結果顯示，經不同濃度的HNPG作用下MG-63細胞增殖、遷移和侵襲受到抑制，伴隨細胞周期G1期比例和細胞凋亡率顯著增高，提示HNPG對MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的抑制，可能與其引起細胞周期G1期阻滯，進而誘導凋亡密切相關，與Song等[16]報道的GEN抑制MG-63細胞增殖和誘導凋亡的效果及其分子生物學機制相似，但HNPG的生物活性顯著高于GEN。

p53蛋白具有誘導細胞凋亡和抑制增殖的作用，其主要在G1/S期交界處發揮檢查點的功能，當其發現線粒體DNA損傷時，通過刺激周期依賴性激酶抑制因子表達引起G1期阻滯，并啟動DNA修復，如修復失敗直接激活bax凋亡基因或下調bcl-2抗凋亡基因表達，啟動細胞凋亡程序，將可能演變為癌細胞消滅在萌芽狀態[17-18]。bcl-2和bax蛋白存在于線粒體的雙層磷脂酶上，二者共同作用調控線粒體膜內外物質轉運，當bcl-2和bax蛋白表達比例失調，導致線粒體內物質轉運異常，進而引起細胞功能障礙[19-20]。本研究結果顯示，經不同濃度的HNPG作用于MG-63細胞后，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡率顯著增高，細胞G1期阻滯和凋亡誘導可能與HNPG上調p53、bax蛋白表達，下調bcl-2蛋白表達相關，與Song等[16]報道的GEN抑制MG-63細胞增殖和誘導凋亡的效果與分子生物學機制相似，但HNPG的生物活性顯著高于GEN。

綜上所述，HNPG在體外可顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲，其分子生物學機制可能是引起細胞DNA損傷，激活細胞內p53蛋白表達，阻滯細胞于G1期，進而上調bax蛋白，下調bcl-2蛋白表達，啟動細胞內預存程序性死亡基因，誘導細胞凋亡所致。然而HNPG在體內是否抑制腫瘤細胞生長增殖，以及HNPG與其他傳統的抗腫瘤藥物是否有協同作用，需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2020-12-05）