卵巢漿液性癌患者腹水中GRB7蛋白與BRCA基因表達的相關性分析

吳珊

[關鍵詞] 漿液性癌;惡性腹水;GRB7;BRCA

[中圖分類號] R737.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）16-0012-04

Correlation analysis between GRB7 protein and BRCA gene expression in ascites of patients with serous ovarian carcinoma

WU Shan

Department of Obstetrics and Gynecology， Xianning Maternal and Child Health Hospital in Hubei Province， Xianning 437000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between GRB7 protein expression and BRCA gene mutation in ascites tumor cells of patients with serous ovarian carcinoma and its clinical significance. Methods From July 2017 to June 2020， cancerous ascites in 31 patients with serous ovarian cancer were collected. The expression of GRB7 protein was detected by Immunohistochemistry（IHC）. The BRCA gene mutation status was detected by high-throughput next-generation sequencing （NGS）. The correlation between the two was analyzed based on clinical characteristics. Results The positive expression rate of GRB7 protein in the ascites of 31 patients with serous ovarian carcinoma was 51.6% （16/31）. The positive expression rate of GRB7 was correlated with distant metastasis of patients（P<0.05）， but it was not related to age， lymph node metastasis， surgery， andradiotherapy/chemical/targeted therapy（P>0.05）. The BRCA gene mutation rate was 22.6%（7/31）， including 5 cases of BRCA1 mutation and 2 cases of BRCA2 mutation.GRB7 correlated with the results of BRCA （r=0.79， P<0.05）. Conclusion Serous cancer ascites cell wax block is a reliable source of specimens for GRB7 protein and BRCA gene detection. GRB7 protein expression is correlated with BRCA gene mutation， and it is a potential treatment and prognostic target for serous ovarian cancer.

[Key words] Serous carcinoma; Malignant ascites; GRB7; BRCA

漿液性癌為卵巢最常見的上皮性惡性腫瘤，病死率占所有婦科惡性腫瘤的首位[1]。當晚期漿液性癌發生腹腔播散后往往失去手術機會，以鉑類和紫杉醇為基礎的化學治療在此取得了一定的效果，但由于患者無法耐受和易短期復發等因素，嚴重影響臨床應用前景，而具有選擇性高、副作用少、作用精準的分子靶向藥物為此提供了新的方向[2]。卵巢漿液性癌與BRCA基因的關系密切，其陽性表達被認為是促進腫瘤發生的重要因素，可以作為臨床制定個性化治療方案、預后評估和隨訪的重要依據[3]。2017版中國婦產科專家共識[4]推薦，所有的卵巢癌無論其年齡及有無家族史，均需要進行BRCA基因檢測。而GRB7蛋白的過表達被認為與乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發生存在著重要的聯系，正成為新的研究熱點[5]。本研究以卵巢漿液性癌患者惡性腹腔積液（Malignant peritoneal effusion，MPE）細胞學為研究對象，探討卵巢漿液性癌患者MPE中的GRB7蛋白表達與BRCA基因突變的相關性及其臨床意義，為細胞學標本的臨床分子學檢測和卵巢漿液性癌MPE患者的個體化診療方案提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2017年7月至2020年6月經病理形態學及免疫組化確診為卵巢漿液性癌的31例MPE患者，年齡34～72歲，中位年齡56歲，同時記錄患者的淋巴結轉移、遠處轉移、有無手術切除及放/化/靶向治療等情況。

1.2 標本的制備

新鮮MPE倒入50 mL試管高速離心，盡可能多地收集腫瘤細胞沉渣，酒精固定后，常規取材、包埋制成細胞學蠟塊。

1.3 免疫組化及抗體

GRB7為美國Agilent公司產品（工作濃度1∶100）。高年資技師常規石蠟4 μm切片，采用SP法按照GRB7試劑說明書規范操作，以磷酸鹽緩沖液和正常卵巢組織為陰性對照，陽性切片為陽性對照。GRB7陽性為棕黃染色，定位于包膜和胞質。按腫瘤細胞表達的陽性占比和強度分別計數，其中（2+～3+）認為表達陽性，（0～1+）認為表達陰性。

1.4 NGS測序

QIAamp DNA FFPE DNA 抽提試劑盒（德國Qiagen公司）按操作說明提取MPE蠟塊基因組DNA;使純度A260/280和濃度分別保持在1.8～2.0 ng/μL和10～15 ng/μL之間;采用二代測序DNA建庫試劑盒（Illumina平臺）構建DNA測序文庫，對目標DNA片段利用特定的探針進行樣本的雜交捕獲;Illumina Miseq 測序平臺進行上機測序，測序讀長和深度為150 bp和>500 X;所得的原始數據進行標準化數據分析并過濾，最后行生物信息學分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計數資料行χ2檢驗及Fisher精確概率法，相關性分析采用Logistic回歸分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GRB7蛋白表達與臨床特征的關系

31例卵巢漿液性癌MPE細胞學蠟塊行石蠟切片和HE染色檢測腫瘤細胞含量（封三圖1）。免疫組化檢測GRB7結果顯示（2+～3+）陽性表達率為51.6%（16/31）（封三圖2），在設立的正常對照卵巢組織中表達陰性或弱陽性。GRB7的陽性表達與腫瘤遠處轉移存在相關性[66.7%（14/21）;20.0%（2/10），P=0.023]，但與年齡（≥50歲）[42.9%（6/14）;58.8%（10/17），P=0.479]、淋巴結轉移[58.3%（14/24）;28.6%（2/7），P=0.221]、手術切除[52.9%（9/17）;50.0%（7/14），P=0.578]及放化療及靶向治療[46.7%（7/15）;56.3%（9/16），P=0.431]無明顯相關性。見表1。

2.2 BRCA基因突變情況

31例卵巢漿液性癌MPE標本中，其中7例檢測到BRCA基因突變，總突變率為22.6%，包括無義突變5例和移碼突變2例。其中BRCA1（封三圖3）和BRCA2（封三圖4）基因突變率為分別16.1%（5/31）和6.5%（2/31）。根據遺傳變異分類指南（ACMGA）和生信分析軟件預測危害結果顯示，其中6例為致病性BRCA基因突變，1例為可能致病（病例5，BRCA1，c.2566T>C）。見表2。

2.3 GRB7蛋白表達及與BRCA基因的相關性

31例卵巢漿液性癌MPE標本中，GRB7蛋白表達及與BRCA基因突變率分別為51.6%（16/31）和22.6%（7/31）。兩者均有陽性表達且一致的有6例，兩者均為陰性表達的14例;不一致者11例，其中BRCA基因突變而GRB7蛋白表達陰性的僅1例病例。采用Spearman分析檢驗兩者相關性發現，GRB7蛋白表達與BRCA基因突變水平呈正相關（r=0.79，P<0.05）。見表3。

3 討論

MPE的成因較為復雜，據統計一半以上的晚期卵巢漿液性癌患者可合并發生[6]。研究認為MPE的發生與漿液性癌細胞惡性程度高、黏附性差，極易穿透卵巢包膜形成腹腔內廣泛播散種植，同時易于侵犯脈管，阻塞淋巴管，使淋巴液回流受阻[7]。當發生MPE時，患者已經處于疾病的絕對晚期，往往失去手術機會，無法取得活檢組織，失去基因檢測的機會，而細胞學蠟塊技術為此提供一個很好的機會，具有微創性、來源方便、可反復操作、易于保存等優點，為進一步基因檢測和預后評估提供了便利[8]。GRB7蛋白作為一類生長因子受體結合蛋白，由535個氨基酸殘基構成，共存在5個功能區，能通過SH2結構區識別磷酸化酪氨酸，激發腫瘤表面受體和特異性下游信號的耦聯，調控下游信號轉導通路[9]。已有研究表明GRB7的過表達能夠獨立或協同其他基因、蛋白參與腫瘤細胞的生長、浸潤和遷徙，能提高ERK磷酸化和FOXM1的水平，激活高級別卵巢漿液性癌的發生，而降低GRB7活性能夠顯著地抑制腫瘤細胞遷移/侵襲、腫瘤生長[10]。BRCA1/2為卵巢漿液性癌的易感基因，BRCA1由1863個氨基酸殘基構成，定位于17q21號染色體上，BRCA2由3418個氨基酸殘基構成，定位于13q12號染色體上[11]。當BRCA基因發生突變后能夠產生截短蛋白，誘導腫瘤細胞重組和修復缺陷，從而破壞基因組的穩定性，促進腫瘤增殖[12]。進一步研究發現BRCA基因突變，同樣也增加了針對DNA雙鏈斷裂和DNA單鏈損傷修復的PARPi抑制劑對腫瘤的敏感性，針對性的用藥能顯著延長患者的生存周期，而未發生BRCA基因突變的晚期患者，由于無敏感性的靶點藥物，預后依然極差[13]。因此，尋找潛在治療和預后評估的靶點，正成為晚期卵巢漿液性癌研究的熱點。

本研究顯示，在31例卵巢漿液性癌MPE患者中，GRB7蛋白陽性表達率為51.6%（16/31）。在與臨床特征的關系上，GRB7蛋白的表達與年齡、淋巴結轉移、手術切除及放化療及靶向治療等因素無關，但與腫瘤的遠處轉移存在明顯的相關性，Wang等[14]應用免疫組化法研究發現GRB7蛋白與卵巢癌進展存在顯著的相關性，提示GRB7蛋白的高表達能夠導致腫瘤的侵襲和遷移，GRB7有望成為評判腫瘤的惡性程度及預后的一個重要標準。31例卵巢漿液性癌MPE患者中共發現7例（22.6%）BRCA基因突變，其中BRCA1突變5例，BRCA2突變2例。突變模式均為無義突變和移碼突變（包括插入突變和重復突變），未發現其他內含子突變。7例突變病例中6例（85.7%）為高致病性突變，1例為可能致病性突變。Eccles等[15]通過大樣本回顧性研究發現卵巢癌中BRCA基因的綜合突變率約為14.1%，其中的高致病BRCA突變約70%。本研究無論是突變率還是所含高致病性突變率均有升高，這可能與亞洲人群相對于歐美人群卵巢癌BRCA基因胚系細胞突變率更高[16]或本研究收集的病例為卵巢漿液性癌MPE樣本惡性程度更高有關。

目前多量的研究證實，GRB7蛋白和Her2基因在乳腺癌中存在著強相關性，兩者在腫瘤發生發展的進程中具有協同性，抑制腫瘤細胞中GRB7的高表達，可以提高Her2抑制劑的抑制效果[17]。而同樣與乳腺癌密切相關的GRB7蛋白和BRCA基因的高表達各自在卵巢癌的發生發展中起到重要的作用。本研究通過分析卵巢漿液性癌MPE中GRB7蛋白表達及與BRCA基因兩者相關性發現，兩者的相關度r值為0.79，證實結果為正相關。提示兩者在卵巢漿液性癌的發生發展中可能存在協同和促進作用，而通過有效的抑制GRB7的高表達，或許能提高針對于BRCA的PARPi抑制劑的效果。目前GRB7蛋白或基因的靶向治療還處于實驗階段，但已有研究結果發現環肽結合磷酸化絡氨酸能夠通過抑制GRB7表達來使腫瘤細胞失去增殖活性，極有可能成為潛在的治療熱點。

綜上所述，卵巢漿液性癌腹水脫落細胞是GRB7蛋白與BRCA基因檢測的可靠標本來源，GRB7的高表達與腫瘤的遠處轉移密切相關，是作為評價卵巢漿液性癌預后的指標。GRB7蛋白的表達與BRCA基因突變存在著相關性，GRB7是卵巢漿液性癌的潛在治療和預后評估的靶點。然而，由于本次納入研究病例較少，且未進一步闡明GRB7與BRCA相互的分子機制及聯系，有待于接下來進一步大樣本的深入研究。

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（收稿日期：2021-01-04）