泛素/26S蛋白酶體途徑調節作物種子大小的研究進展

崔超, 趙阿慧, 李芳, 高翔,2*, 邢玲玲,董劍,2, 趙萬春,2, 楊明明,2*

(1.西北農林科技大學農學院, 陜西 楊凌 712100; 2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心, 陜西 楊凌 712100; 3.博愛縣農業農村局, 河南 焦作 454450)

高產是作物育種永恒不變的目標。對于禾谷類作物，種子大小和構型是影響產量的重要因素[1]。種子大小是由多基因控制的數量性狀，受多種途徑的調控，包括泛素/26S蛋白酶體系統(ubiquitin/26S proteasome system，UPS)、G蛋白信號、絲裂原活化蛋白激酶信號、植物激素感知和體內平衡以及轉錄調節因子等[1-2]。野生植物為了繁衍后代，大多都維持著小種子的特性。但是，水稻、小麥、玉米等以收獲種子為目標的糧食作物，在不斷的人為選擇和馴化過程中，籽粒逐漸變大。隨著人口不斷增長，研究作物種子大小及其調控機理對人類糧食安全至關重要。

成熟完整的種子由胚、胚乳和種皮組成[1-2]。植物雙受精過程中，一個精細胞與卵細胞結合形成受精卵，發育成二倍體的胚；另一個精細胞與中央細胞結合，發育成三倍體的胚乳；珠被發育成種皮。胚、胚乳和種皮的協調生長決定著種子的大小[1]。小麥、玉米、水稻等禾本科植物種子的種皮與果皮緊密連接在一起，難以區分，因此，果皮與種皮的空腔大小共同決定了種子的大小。果皮由子房壁發育而來，種皮由珠被發育而來，通常子房壁和珠被均由母體遺傳物質控制。因此，種子大小由母體的遺傳物質與合子的遺傳物質共同決定[1-2]。另外，小麥、水稻等植物包裹種子的穎殼也由母體遺傳物質控制[1]，由此表明，母體遺傳物質在種子大小的調控中發揮重要作用。

泛素/26S蛋白酶體系統普遍存在于真核生物蛋白質翻譯后的修飾過程中，據報道，擬南芥中約6%的基因組參與其中[3-6]。該系統由泛素、泛素激活酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成[3-5]。其中，泛素連接酶在該系統中起特異識別作用，通過在目標蛋白上連接不同數量的泛素進行泛素化修飾來介導目標蛋白的降解和改變蛋白活性等，對植物非生物脅迫響應、信號傳遞、種子大小、開花時間、育性等方面起著重要作用[3-5]。

1 泛素/26S蛋白酶體系統組成

1.1 泛素

泛素(ubiqutin，Ub)于1975年首次被純化，是一種高度保守的低分子量蛋白質，廣泛存在于真核細胞中，由76個氨基酸組成，分子量約為8.5 kD[4-5]，可共價連接到目標蛋白，導致目標蛋白以依賴ATP和Mg2+的方式降解[5]。泛素的穩態受去泛素化酶的嚴格調控[5]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有14個泛素編碼基因，可分為三種類型：多聚泛素基因、類泛素基因和泛素延伸基因。其中，多聚泛素基因和類泛素基因由228 bp的單泛素串聯重復組成[4]。在單個泛素分子中包括7個賴氨酸殘基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63)組成的ε-氨基或泛素N端氨基，它們可與下一個泛素的C端羧酸相連形成聚合泛素鏈，不同部位的連接參與不同的調控[4]。目標蛋白可以在一個或多個位點連接一個泛素分子(單泛素化)，也可以在一個或多個位點連接泛素鏈(多泛素化)[5]。

1.2 泛素激活酶

泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1s)大小為110～125 kD[6]，可以將失活的泛素活化。不同生物中泛素激活酶的編碼基因數量不同，在酵母中含有1個[4]，擬南芥和煙草(Nicotianatabacum)中存在2個[4-5]，小麥(Triticumaestivum)中發現3個[5]，而大豆(Glycinemax)中報道了4個[4,6]。E1s含有四個不同的結構域：兩個ThiF同源基序組成的腺苷酸化結構域、兩個半結構域(first catalytic cysteine half-domain，FCCH；second catalytic cysteine half-domain，SCCH)組成的催化半胱氨酸結構域、四螺旋束結構域(four-helix bundle，4HB)和C末端泛素折疊結構域(ubiquitin-fold domain，UFD)[4,6]。E1s的C末端泛素折疊結構域可特異性識別同源泛素結合酶[6]。

1.3 泛素結合酶

泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2s)中有一個保守的半胱氨酸殘基作為活性位點與泛素分子(Ub)形成硫酯鍵，泛素活化酶E1將泛素轉移到E2的半胱氨酸活性位點上，形成Ub-E2復合體。E2s的半胱氨酸(Cys)殘基位于高度保守的泛素結合結構域(ubiquitin-conjugating，UBC)[4,6]。在擬南芥中有8種UBC蛋白缺乏硫酯形成所需的活性位點Cys殘基[6]。起初，E2s被認為是起輔助作用的“泛素載體”，而最近研究表明，E2s可以控制泛素鏈從起始到延伸的轉換，并控制形成泛素鏈的拓撲結構，從而決定被修飾目標蛋白的使命[6]，例如：修復DNA、調控植物生長發育、響應脅迫等[4]。

1.4 泛素連接酶

泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes，E3s)在蛋白質的泛素化過程中起特異性識別目標蛋白的關鍵性作用。擬南芥中約5%的基因組與泛素連接酶有關[4]，大豆中有1 356個基因與E3s相關[6]。根據結構域可以將E3s分為四大類：HECT(homologous to the E6-AP carboxy terminus)結構域家族、RING(really interesting new gene)結構域家族、U-box結構域家族和CRLs(cullin-RING ubiquitin ligases)結構域家族[3-6]。其中，HECT型、RING型和U-box型為單亞基E3s，而CRLs型為多亞基E3s[3-6]。

1.4.1HECT型E3s HECT型E3s的C端為α/β結構[4]，其保守結構域HECT約由350個氨基酸組成[3-4,6]，具催化作用，其催化活性位點為Cys820，介導Ub從E2到目標蛋白的直接轉移[4-5]。HECT的典型結構為E6-AP[4]。擬南芥中有7種HECT蛋白，分別為UPL1～UPL7[5]。

1.4.2RING型E3s RING型E3s的結構域約由40～60個氨基酸組成，富含Cys[3,5]，協調兩個鋅原子[5]。擬南芥中有超過470種蛋白質包含RING結構域[5]。研究證明，RING型E3s在植物不同發育過程中均有重要作用，包括種子萌發、生長、根發育、光信號轉導、配子形成、器官大小和對非生物脅迫的響應等[3-5]。RING型E3s數量眾多，在擬南芥中有469個基因編碼RING型E3s，大豆中有760個[6]。目前RING型E3泛素連接酶的研究已逐漸成為熱點[3-6]。擬南芥中已鑒定出7種類型的RING結構域，包括兩種典型的RING類型(RING-HC和RING-H2)和五種修飾的RING結構域類型(RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T和RING-G24-27)[7]。與HECT型E3s相反，RING結構域主要通過8個氨基酸與Zn2+的螯合形成共價鍵來間接轉移泛素[3]。除此之外，RING型E3s也參與多亞基E3s的形成[4]。

1.4.3U-box型E3s U-box結構域由約70個氨基酸組成，缺乏經典的鋅螯合Cys和組氨酸(His)殘基[3]，主要通過鹽橋、離子螯合以及氫鍵從E2s轉移泛素至目標蛋白，進行泛素化修飾[4]。植物中有較多的U-box型E3s[3]。其中，擬南芥檢測到64個成員，水稻中有77個成員[3]，大豆中有124個成員[6]，這類蛋白可能參與植物自交不親和、種子萌發、花期、葉綠體發育和非生物脅迫響應等[5]。

1.4.4CRLs型E3s CRLs型E3s是多亞基E3s，由cullin骨架蛋白、E2結合蛋白RBX1 (RING box 1)和結合cullin的底物識別亞基構成[3]。CRLs型E3s又可分為四個亞家族：SCF(SKP1-Cullin1-F-box)、BTB(Bric-a-brac-Tram track-Broad)、DDB(DNA Damage-Binding domain-containing)和APC(anaphase-pro-moting complex)[4-5]。其中，SCF亞型E3s由SKP1(sphase kinase-associated protein 1)、CUL1(cullin 1)、RBX1(RING-box 1)和FBX(F-box)蛋白組成，FBX蛋白決定底物特異性[5]。擬南芥中有超過700個基因參與CRLs型E3s，部分基因參與植物激素信號通路、植物發育和各種非生物脅迫響應[5]等。擬南芥中已鑒定的5種經典cullin蛋白(CUL1、CUL2、CUL3a、CUL3b和CUL4)均屬于E3s復合物的組分[3]。

1.5 26S蛋白酶體

26S蛋白酶體在真核細胞中負責蛋白質的降解，以消耗ATP的形式特異性將靶蛋白降解成由7～9個氨基酸殘基組成的多肽。結構上由19S調節亞基和20S核心亞基組成[5,8]。其中，19S調節亞基能夠識別帶有泛素鏈標記的蛋白質底物并將其去折疊，然后將去折疊后的蛋白質底物運送至20S核心亞基中進行降解[8]。26S蛋白酶體參與了植物的絕大多數生命活動[8]。它能將含有泛素鏈(≥4個泛素分子)的目標蛋白降解為較小的肽段，而釋放的泛素分子則被回收[5]；對于單泛素化蛋白質無法進行降解，但單個泛素分子通過與泛素受體蛋白結合會影響其他修飾蛋白的功能或活性，進而調控植物的生長發育[5]。

1.6 去泛素化酶

去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)具有從線性串聯重復序列中產生游離泛素的功能，還能夠通過水解泛素分子之間的異肽鍵來修剪泛素鏈，以及從蛋白質中去除共價結合的泛素。DUBs是一個大的蛋白質家族，根據其特有的催化結構域可分為五類：泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP/UBP)、泛素碳末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢腫瘤結構域蛋白酶(ovarian tumor domain protease，OTU)、Machado-Jo-seph疾病蛋白結構域蛋白酶(machado-jo-seph disease protein domain protease，MJD)和JAMM基序蛋白酶(jab1/mpn/mov34 protease，JAMM)[9]。

2 泛素介導的26S蛋白酶體降解途徑

UPS系統由Ub、E1s、E2s、E3s、DUBs、26S蛋白酶體組成[3-5](圖1)。首先，細胞質與細胞核中的E1s在ATP參與下將失活的Ub激活；Ub的C末端和E1s的Cys殘基之間以硫酯鍵結合(E1-Ub)。然后，硫酯連接的泛素(E1-Ub)被轉移到E2s的Cys殘基活性位點上，再經過硫酯鍵進行結合，形成E2-Ub。此時E3s與目標蛋白和E2-Ub形成復合物，直接或間接介導活化的Ub轉移到目標蛋白上，使Ub分子C端的甘氨酸(Gly)殘基與目標蛋白的賴氨酸(Lys)殘基之間形成異肽鍵[5]。Cys殘基是整個E3s具有活性的關鍵殘基。此外，包括半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸在內的殘基也可以被泛素修飾[5]。直接轉移的E3s為HECT型E3s，可將Ub轉移至E3s，形成E3-Ub，E3-Ub中E3與目標蛋白結合后進行旋轉，使得Ub與目標蛋白進行結合；間接轉移的E3s有RING型、U-box型和Cullin-based型，E2-Ub直接與目標蛋白結合，E3發揮橋梁作用。最后，含有多聚泛素鏈(≥4個泛素分子)修飾的目標蛋白被26S蛋白酶體降解，釋放Ub[3-6]。

3 泛素/26S蛋白酶體系統調節器官和種子大小

3.1 泛素受體類基因

擬南芥AtDA1是一個泛素受體類基因，其編碼蛋白包含兩個泛素相互作用的基序(ubiquitin iteraction motifs, UIM)結構域、一個LIM結構域和一個C末端肽酶結構域[10-11]。AtDA1對于種子大小具有重要作用[10,12-19]。它通過限制母體珠被中的細胞增殖來控制種子大小[10-11,14]。該基因第358位點的堿基由G突變為A(AtDA1R358K)后，導致原本的精氨酸變異為賴氨酸，使得突變體種子和器官的大小增加[10]。DAR1和DAR2(DA1的兩個同源基因)也具有調控種子大小的作用。

甘藍型油菜BnDA1基因發生突變后，突變體Bnda1的種子產量和生物量得到提高。過表達AtDA1R358K增加了轉基因油菜的千粒重和器官大小，提高了單株產量。由此可見，BnDA1和AtDA1在調控種子和器官大小方面具有相似的功能[12]。

玉米ZmDA1或ZmDAR1發生突變后，突變體Zmda1和Zmdar1穗長增加，導致行粒數增加。且突變體比野生型具有更加發達的基生胚乳轉移細胞層(basal endosperm transfer cell layer，BETL)，增強了淀粉合成酶基因的表達，改善了糖向庫器官的輸入以及玉米籽粒中淀粉的合成。ZmDAR1主要在玉米胚乳發育中起作用，ZmDA1在胚發育中起重要作用，糖與淀粉含量的增加使胚乳或胚增加，導致籽粒重量增加。這與AtDA1/AtDAR1調控種子大小存在一定差異，可能是由于兩個物種調控途徑中降解的底物不同，ZmSWEET4c可能是ZmDA1的潛在底物[13]。

普通小麥TaDA1基因通過限制母體果皮細胞的增殖來負調控小麥籽粒大小。TaDA1-A與TaGW2-B對粒重具有加性效應，同時下調TaDA1和TaGW2的表達使小麥的籽粒大小與重量增加。TaDA1位于小麥2A、2B和2D染色體，TaDA1-B和TaDA1-D主要在營養器官(如葉和根)中表達，而TaDA1-A主要在生殖器官(如幼穗)中表達，可能在籽粒重量和大小方面起重要作用[14]。DA1基因第358位點發生突變會抑制DA1和DAR1蛋白的活性，使得擬南芥、油菜和玉米的種子大小增加[10,12-13]。但是，這種突變至今還沒有在自然變異中被發現。Liu等[14]研究表明，啟動子區域的變異會改變TaDA1-A三種單倍型的表達水平。

水稻中鑒定出4個同源基因OsDA1、OsDAR2、OsDAR3和OsDAR4[15,18]。這些同源基因可能作為轉錄因子來正向調控水稻的粒寬和粒長，從而增加千粒重和單株產量[15,18]。李愛芹等[17]研究表明，OsDA1基因的啟動子區存在多個不同激素和逆境信號響應的順式作用元件，但這些元件的類型與擬南芥DA1基因的順式作用元件有所不同，OsDA1與AtDA1可能在表達調控上存在差異[15,17-18]；OsDA1基因不僅能夠調控種子等器官的大小和發育[17]，還可能與激素信號轉導和逆境響應有關[16-17]。郝健均[19]指出，OsDA1R310K的過量表達使轉基因植株的器官(營養器官和生殖器官)和種子增大。

對栽培大豆(Glycinemax,G.ma)和野生大豆(Glycinesoja,G.so)的DA1基因在序列和表達水平進行比較，GsoDA1基因在根、莖和葉中的表達水平高于生殖器官和發育中的果實，該基因的過表達影響了轉基因擬南芥種子的萌發和對鹽脅迫的敏感性，但對種子大小無顯著影響[16]，這與擬南芥[10]、甘藍型油菜[12]、玉米[13]和普通小麥[14]中的研究結果不一致。由此可見，DA1基因在植物中可能具有多種功能，同源基因間的保守性及其功能受親緣關系遠近的影響[19]。

3.2 泛素連接酶類基因

3.2.1GW2基因OsGW2是水稻中發現控制粒寬和粒重的RING型E3類主效基因，在不同組織中均有表達。OsGW2基因的功能是通過泛素介導的蛋白質水解調控細胞分裂，改變小穗穎殼中的細胞數量。該基因第4個外顯子發生1 bp的缺失突變，形成終止密碼子，使該基因提前終止(在第310個氨基酸處被截斷)，導致粒寬、粒重和籽粒灌漿速率增加[7]。OsGW2與幾丁質酶14和磷酸甘油酸激酶相互作用，但不會使這些蛋白質泛素化，而是通過調節參與碳水化合物代謝的蛋白質活性或穩定性以及種子發育過程中二硫鍵的形成來控制糊粉層的發育，直接調控種子大小[20]。OsGW2與膨脹素(一種促進細胞生長的細胞壁松弛蛋白)共定位于細胞核， OsGW2通過其E3活性促進膨脹素降解而負調控種子大小[21]。在日本品種(Koshihikari)中發現一個突變體KEMS39，其籽粒大小和產量顯著增加，并且節間較厚，耐貯藏性和抗倒伏能力提高，研究表明，該突變體的OsGW2基因第6個內含子的3′剪接位點發生突變，導致mRNA中存在67 bp的缺失[22]。

玉米中發現了OsGW2的兩個同源基因：ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5。ZmGW2-CHR4啟動子區發現了一個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，該多態性與籽粒寬度和百粒重顯著相關，ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5其他區域的SNPs(插入/缺失多態性)也發現與產量性狀(籽粒長度、籽粒厚度、籽粒寬度和百粒重)顯著相關[23]。ZmGW2可以被高鹽(NaCl)和脫落酸(abscisic acid，ABA)誘導[24-25]，具有抗旱和抗冷害的能力，將過表達ZmGW2載體和AtGW2RNA干擾(RNA interference，RNAi)載體轉入擬南芥發現，AtGW2RNA干擾植株后代的籽粒比過表達ZmGW2轉基因后代的更大，千粒重更高，表明ZmGW2具有負調控種子大小及粒重的作用[24-25]；非生物脅迫處理后，ZmGW2轉基因植株長勢均優于野生型，表明其在逆境脅迫響應中也發揮作用[24]。

大豆GmGW2全長8 467 bp，包含8個外顯子和7個內含子，編碼431個氨基酸，不含跨膜結構域及信號肽，編碼具有Zinc finger和RING-type結構域(第50～100個氨基酸)的不穩定親水蛋白[26-27]。

小麥TaGW2-6A的啟動子區存在2個SNPs：Hap-6A-A(-593A和-739G)和Hap-6A-G(-593G和-769A)。TaGW2表達水平與粒寬呈負相關，而Hap-6A-A的作用類似于水稻中功能缺失突變，導致粒寬和粒重增加[28-30]。Bednarek等[31]通過RNAi和基因敲除表明，TaGW2可能通過控制胚乳細胞數量正向調控小麥籽粒大小。因此，小麥和水稻中GW2基因似乎具有相反的功能[31]。Yang等[32]在蘭考大粒品種TaGW2-6A基因的第8個外顯子中發現了一個T堿基插入形成的終止密碼子，該單倍型在雜交分離群體中可以穩定遺傳，該突變可以顯著提高小麥的粒寬和粒重[32]。進一步研究發現，通過調控細胞分裂素、赤霉素、淀粉合成來提高籽粒大小[33-36]。Jaiswal等[37]在印度小麥TaGW2-6A基因的啟動子序列中鑒定出4個與千粒重顯著相關的SNPs(G/A或A/G突變)[37]。Simmonds等[38]在四倍體Kronos EMS TILLING群體TaGW2-A1基因第5個外顯子的剪接受體位點發現了一個從G到A的顛換，將突變等位基因Tagw2-A1回交到四倍體小麥Kronos和六倍體小麥Paragon中,能顯著增加四倍體和六倍體小麥的千粒重、粒寬和粒長，并發現在開花前5 d心皮長度與寬度顯著增加，推測TaGW2-A1在開花前作用于母體組織以限制種子大小[38]。利用CRISPR/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)敲除TaGW23個同源基因(TaGW2-A1、TaGW2-B1和TaGW2-D1)中的1個、2個或3個發現，敲除TaGW2-B1的突變體比敲除TaGW2-A1、TaGW2-D1具有更高的粒寬、粒長和粒重，且雙突變體的千粒重顯著大于單突變體[39-40]；進一步研究表明，TaGW2通過調節籽粒外層果皮中的細胞數量和長度來負調控小麥籽粒大小[39]。Qin等[41]研究表明，六倍體小麥中TaGW2-6B對千粒重的影響大于TaGW2-6A，且兩個基因間具有加性效應。Zhai等[42]在高千粒重親本中發現TaGW2-A1基因的5’側翼區缺失了114個堿基，導致TaGW2-A1啟動子的活性和表達量降低，對小麥千粒重和粒寬起負調控作用。

大麥中HvYrg1和HvYrg2是水稻GW2的同源基因，該基因的表達量下調導致千粒重增加，種子變大，且營養器官也發生較大變化[43]。

3.2.2EOD1/BIGBROTHER基因 擬南芥中EOD1(enhancer of DA1,EOD1)突變增強了da1-1突變體種子和器官的大小[10,44]。EOD1基因被定位于BIGBROTHER(BB)位點，編碼一種泛素連接酶，該蛋白含有一個RING型結構域，在擬南芥活躍組織(莖、花、根的分生組織和幼嫩器官)和維管束系統中表達，通過E3活性降解目標蛋白來調控器官的發育，對器官形態起負調控作用[45-46]。EOD1/BB的E3活性和泛素受體活性與DA1的潛在偶聯單泛素化活性密切相關，由此表明，泛素細胞信號機制直接參與植物器官大小的調控[10]。在營養器官中，BB基因的表達水平與有絲分裂活動密切相關；在有絲分裂活動旺盛的器官中表達量較高，且表達量隨著細胞有絲分裂活動的減少而降低[45]。通過對P271(大籽粒)和中國春(小籽粒)小麥發育初期的籽粒進行轉錄組和蛋白質組數據的關聯分析發現一個新型BB基因Tares_1AL_B4BCDBC4A，該基因在籽粒發育初期表達量顯著增加，并且在籽粒發育過程中均維持較高水平；其氨基酸序列在487～533位置上含有一個典型的Zinc finger RING-type結構。將該基因轉入科農199，轉基因株系的籽粒顯著變小。除此之外，還發現細胞色素酶基因TaCYP78A5在中國春及P271中的表達量存在極顯著差異，推測該基因可能與BB基因相互作用參與籽粒大小的調控[47-49]。

3.2.3DA2基因 擬南芥DA2基因的編碼蛋白(DA2)具有E3活性，含有一個RING型結構域，在根、莖、葉和花中均有表達，通過影響種子中母體珠被細胞的增殖來調控種子大小。da2-1突變體的種子顯著大于野生型，而DA2的過表達使轉基因植株的種子減小[44]。DA2的RING域與水稻GW2的環域(C5HC2)高度相似，但DA2 RING域中保守的His殘基被Asn殘基(Asn-91)取代。研究表明，DA2與DA1間存在協同互作[50]，而DA2和BB相互獨立[44]。

3.2.4SDIR1基因SDIR1基因編碼具有RING結構域的E3 SDIR1(salt-and drought induced really interesting new gene finger 1)，在植物信號調節通路中發揮重要作用。小麥TaSDIR1-4D共檢測到2個SNP，一個位于編碼區上游序列-583 bp處(T/C)，另一個位于編碼區第4外顯子上(G/A)，使精氨酸(Arg)變為組氨酸(His)，兩種單倍型的千粒重和穗長存在顯著差異[51]。

SDIR1的N端含有兩個跨膜結構域，C端含有一個C3H2C3環型結構域，在植物中通過泛素化途徑對鹽和干旱脅迫下ABA介導的抗逆反應起關鍵作用[52]。小麥TaSDIR1-4A與千粒重顯著相關，基因表達分析表明TaSDIR1-4A在旗葉中表達量最高；該基因啟動子區存在兩個核苷酸變異位點，產生兩種單倍型Hap-4A-1和Hap-4A-2，Hap-4A-1的表達量顯著高于Hap-4A-2，而Hap-4A-2的千粒重顯著高于Hap-4A-1，這種差異可能是由于在Hap-4A-2中TaERF3(乙烯反應因子)對TaSDIR1-4A的轉錄阻遏作用，因此，TaSDIR1-4A對籽粒大小起負調控作用[52]。正常條件下TaSDIR1-4A的低水平表達可能有助于提高小麥產量；而在非生物脅迫條件下，TaSDIR1-4A的上調可能有助于脅迫響應，但可能會降低產量。這表明TaSDIR1-4A是復雜網絡的中央控制單元，在不斷變化的環境條件下平衡響應[52]。

3.2.5PUB1基因 U-box型E3s基因在逆境脅迫和激素應答等方面起重要作用[5]。大豆GmPUB1基因編碼439個氨基酸，分子質量為48.63 kD，GmPUB1蛋白具有U-box結構域，在細胞核和細胞質內均有分布。過表達GmPUB1的轉基因擬南芥千粒重顯著提高[53]。

3.2.6后期促進復合物 后期促進復合物(anaphase-promoting complex，APC)是一種多亞基E3，通過泛素化細胞周期蛋白來調控有絲分裂進程。SAMBA是APC的負調控因子，通過影響細胞增殖來調控種子和器官的發育[54]。samba突變體表現出較大的種子和器官，研究顯示，其細胞周期蛋白A2;3含量增加，由此表明SAMBA通過調節A型細胞周期蛋白的穩定性來調控種子大??；并且samba與da1-1、eod1-2對種子和器官大小起協同作用，SAMBA可能與DA1和BB在同一途徑中對種子大小起調控作用[54]。

3.3 去泛素化酶基因調節種子大小

3.3.1SOD2/UBP15基因 擬南芥中泛素特異性蛋白酶15(ubiquitin-specific protease 15, UBP15)是一種去泛素化酶，由DA1的抑制因子2基因(suppressor 2 ofDA1,SOD2)編碼，它通過促進胚珠、珠被和發育中種子細胞增殖，在母系中正向調節種子大小[50]。sod2/ubp15突變體形成小種子，而SOD2/UBP15過表達使轉基因植株種子變大。DA1與UBP15物理結合并調節UBP15的穩定性。UBP15的C末端區域是與DA1相互作用的必要元件[50]。UBP15可以被多重單泛素化的DA1切割，失去功能導致種子變小[11]。

水稻中OsUBP15與擬南芥AtUBP15同源，由LG1編碼，具有去泛素化酶活性。OsUBP15的功能缺失或下調導致籽粒變小，相較于野生型OsUBP15，突變體Osubp15增強了蛋白的穩定性，且OsUBP15與OsDA1存在直接作用[55]。遺傳分析表明，OsUBP15和OsGW2在調節籽粒寬度和大小方面可能存在互作，OsUBP15通過影響小穗穎殼內的細胞增殖正向調控粒寬和籽粒大小[55]。

3.3.2UBP12和UBP13基因 UBP12和UBP13在DA1、DAR1和DAR2的上游起作用，可以從這些蛋白質中去除泛素以影響它們的蛋白酶活性，使它們處于非活性狀態，從而對植物的生長和發育起微調作用[56]。

3.3.3OTU1和OTUB1基因 組蛋白2(H2A和H2B)的單泛素化與植物生命活動密切相關。如H2B單泛素化會影響植物的生長、種子休眠、根和葉生長、晝夜節律鐘、開花時間和光形態發生等，H2B單泛素化反過來影響組蛋白3(H3)和4(H4)的甲基化和乙?；癄顟B，最終導致相應基因的轉錄抑制或激活[57]。擬南芥中OTU1(otubain樣半胱氨酸蛋白酶)為組蛋白去泛素化酶，是一種影響種子和葉片大小的核質蛋白，在幼嫩組織中表達量較高。OTU1負調控DA1和DA2的表達，其功能缺失導致靶基因轉錄激活；OTU1功能缺失對BB表達無顯著影響，由此表明，兩種泛素介導的通路可能由不同的染色質修飾因子轉錄調控[57]。

WTG1(wide and thick grain 1)編碼一種與人OTUB1同源的去泛素化酶，屬于卵巢腫瘤域蛋白酶(OTU)家族[58]。WTG1/OsOTUB1的過表達導致籽粒細長，且籽粒數量減少，wtg1-1突變體表現為寬、粗、短粒，粒重增加，穗粒數也顯著增加；WTG1/OsOTUB1主要通過影響小穗穎殼中細胞膨脹來調控種子的大小和形狀，還通過促進水稻OsSPL14(squamosa promoter binding protein-like 14)、IPA1(ideal plant architecture 1)、WFP(wealthy farmer’s panicle)的降解來調節株型[59]。WTG1/OsOTUB1限制OsSPL14 K63連接的泛素化，而促進K48連接的泛素化以調節其穩定性，也可能以下游細胞擴增調節劑為目標來調控種子大小[2]。

3.4 UPS對種子大小的調控網絡

在擬南芥中，組蛋白去泛素化酶OTU1負調控DA1和DA2的表達，其功能缺失導致靶基因轉錄激活[57](圖2)。轉錄激活后，DA2和BB都能在多個位點單泛素化DA1，從而激活DA1的肽酶活性。活性DA1肽酶可以裂解多種生長調節劑來調控種子和器官的生長，如PUB15[11]。PUB15通過調節珠被中細胞增殖來促進種子生長[50]。激活的DA1還可以反向調控裂解或破壞BB和DA2的穩定性[11]。

圖2 泛素/26S蛋白酶體系統控制種子大小Fig.2 Ubiquitin/26S proteasome system controls seed size

小麥TaGW2-6A突變通過UPS阻止目標底物的降解，并調控CK和淀粉相關基因的表達，從而間接影響籽粒的灌漿速率、淀粉積累速率和胚乳細胞大小，最終影響籽粒大小和粒重[35]。

4 展望

種子大小是影響幼苗活力和早期生長的關鍵性狀，也是決定作物產量的關鍵因素，而產量是關系糧食安全的重要問題[43]。種子大小是數量性狀，因此具有復雜的調控機制。對種子大小調控機制的解析任重而道遠。盡管已經報道了多個基因、多條途徑，但大多僅限于基因功能的驗證，其上下游的互作基因及蛋白仍然有待挖掘。

蛋白質翻譯后修飾是一種重要的調控機制，通過在蛋白質氨基酸側鏈上共價結合一些小分子化學基團來調節蛋白質的結構、活性、定位和蛋白質間的互作，從而決定蛋白質的生物學功能[60]。泛素/26S蛋白酶體系統是蛋白質泛素化的重要途徑，作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾過程，在作物生長發育的各個階段發揮著重要作用。目前，編碼該系統的目標基因被廣泛研究，但多數集中于E3s，因為E3s在該系統中能夠特異性的識別目標蛋白。泛素/26S蛋白酶體系統被鑒定為模式植物調控種子大小的保守途徑[1]。DA1是該調控途徑的核心成分，其作用與DAR1部分重疊[10-11]。在擬南芥、甘藍型油菜、玉米和小麥等作物中都對DA1的功能進行了驗證[11-14]。該基因在不同物種間具有相似的作用，意味著種子大小的調控機制具有一定的保守性。如水稻OsGW2的同源基因在小麥、擬南芥和玉米中被證明也具有調控籽粒大小的功能[23-25,28-40]。除已報道的基因外，仍有大量未知的E3s，其調控網絡及作用機理有待進一步深入研究。因此，未來對泛素/26S蛋白酶體系統的研究仍然是一個重要的研究方向?，F代分子生物學特別是基因組學和生物信息學的迅猛發展將繼續推動這一進程。