基于PI3K/Akt通路沉默miR-26b對妊娠期高血壓胎盤滋養細胞增殖、凋亡的影響

張佳慧，馬紅云，秦 娟

(江蘇省如皋市人民醫院產科，江蘇 如皋 226500)

妊娠期高血壓屬于一種妊娠期特有的疾病，此病的臨床癥狀多表現為在妊娠20周之后患者出現蛋白尿、高血壓、水腫等，且嚴重的威脅著母嬰生命安全[1]。目前隨著臨床上對妊娠期高血壓的不斷深入研究發現，在此病的發生過程中胎盤功能障礙發揮著重要的作用，在整個妊娠過程中，胎盤滋養細胞增殖、凋亡情況不僅會影響胎盤的生理功能，還在一定程度上影響著整個妊娠過程中母嬰安全和妊娠結局[2]。目前臨床上對于妊娠期高血壓的具體發病機制尚不完全明確，但部分研究認為，此病的發生與微小RNA相關，微小RNA為內源性單鏈小RNA，其經多種途徑參與妊娠期高血壓的發生[3]。基于上述研究背景，現分析沉默微小RNA-26b(Micro RNA-26b，miR-26b)對妊娠期高血壓胎盤滋養細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響，旨在為臨床上妊娠期高血壓的研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料 研究細胞：人胎盤滋養細胞株HTR-8/SV-neo購自山東大學齊魯醫院臨床基礎研究所。本研究經醫院倫理委員會批準。

主要試劑：N-硝基-L-精氨酸甲酯(Sigma公司)；miR-26b過表達質粒、miR-26b沉默質粒構建(上海吉瑪公司)；Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠PI3K抗體、兔抗大鼠p-PI3K抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗大鼠Bax抗體(武漢益普生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導胎盤滋養細胞構建使用N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導胎盤滋養細胞模擬妊娠期高血壓微環境，將所購買的人胎盤滋養細胞株HTR-8/SV-neo放置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在溫度為37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，培養至細胞密度在80%左右時，使用100 μmol/L的N-硝基-L-精氨酸甲酯進行干預，干預培養48 h后收集細胞，做后續試驗。

1.2.2細胞轉染 查找miR-26b序列，構建miR-26b過表達質粒、miR-26b沉默質粒，由上海吉瑪公司設計并合成，miR-26b過表達質粒引物：5′-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3′，miR-26b沉默質粒引物：5′-ACCUAUCCUGAAUUACU-UGAA-3′。將所培養的細胞分為3組，即為N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導胎盤滋養細胞后不做任何處理的空白組、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導胎盤滋養細胞后做miR-26b過表達質粒轉染的過表達組、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導胎盤滋養細胞后做miR-26b沉默質粒轉染的沉默組，將所構建的miR-26b過表達質粒、miR-26b沉默質粒采用Lipofectamine 2000試劑盒轉染至過表達組、沉默組細胞中。轉染24 h后觀察細胞變化。

1.2.3細胞增殖的檢測 使用MTT比色法測定，將所測定的細胞濃度進行調整，調整濃度為3×104個/mL，上述操作完成后將所測定的細胞在96孔板中接種，每孔中加入200 μL的細胞懸液培養24、48、72 h后(培養環境為37 ℃、5%CO2)將10 μL MTT試劑加入，孵育4 h，使用酶標儀測定OD值，計算增殖率。細胞增殖率=(檢測的細胞組OD值/空白組OD值)×100%。重復測量5次，取均值。

1.2.4細胞凋亡檢測細胞凋亡情況 使用TUNEL法測定，將所培養的細胞做洗滌、DAPI染色封片后的細胞核分別呈現為藍色熒光、綠色熒光，其中藍色熒光表示陰性細胞數，綠色熒光表示陽性細胞數，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。重復測量5次，取均值。

1.2.5細胞PI3K/Akt通路蛋白檢測細胞磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路蛋白表達情況使用Western Blot法測定，對所培養的細胞做離心、蛋白提取，提取完成后使用BCA做蛋白定量測定，將所提取的50 μg蛋白加入至2×SDS凝膠緩沖液中，做電泳、轉膜、取膜、固定、封閉處理，將1∶1 000比例的TBST稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax一抗，在溫度為4 ℃的環境下孵育過夜，TBST重復做3次洗膜處理，加入1∶10 000 TBST稀釋的二抗，搖動孵育60 min，TBST重復做3次洗膜處理，使用DAB做顯色處理，分析蛋白表達情況。以GAPDH蛋白為內參。重復測量5次，取均值。

1.3統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗，組內不同時間點比較進行重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組細胞miR-26b表達量比較 與空白組相比過表達組miR-26b表達量升高，沉默組miR-26b表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，說明miR-26b轉染成功。見表1。

表1 3組細胞miR-26b表達量比較Table 1 Comparison of miR-26b expression in three groups

2.23組細胞增殖情況比較 過表達組24 h、48 h、72 h細胞增殖率逐漸降低，沉默組逐漸升高，3組在組間、時點間、組間·時點間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞增殖情況比較Table 2 Comparison of cell proliferation in three groups

2.33組細胞凋亡情況比較 TUNEL法檢測細胞凋亡所獲得的圖像顯示，空白組細胞核綠色熒光占比低于藍色熒光占比，有細胞碎片，細胞存在凋亡現象；過表達組細胞凋亡數量明顯升高，其細胞核多為綠色熒光，細胞核破裂，有細胞碎片；沉默組有少量細胞凋亡，細胞核多為藍色熒光。見圖1。與空白組相比，過表達組細胞凋亡率升高，沉默組降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖1 細胞凋亡TUNEL圖(× 40)A.空白組；B.過表達組；C.沉默組Figure 1 TUNEL of apoptosis(× 40)

表3 3組細胞凋亡情況比較Table 3 Comparison of apoptosis in three groups

2.43組細胞PI3K/Akt通路蛋白表達量比較 與空白組相比，過表達組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與空白組相比，沉默組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達量升高，Bax蛋白表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達量升高，Bax蛋白表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 3組細胞PI3K/Akt通路蛋白表達量比較Table 4 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression in cells among three groups

圖2 Western Blot法測定PI3K/Akt通路蛋白的Western blot圖Figure 2 Western Blot diagram of PI3K/Akt pathway protein detected by Western blot

3 討 論

妊娠期高血壓在妊娠期較為常見，目前對于此病的確切誘發機制尚不完全明確，但就目前研究來說，此病的發生與多種因素相關，包括血管內皮損傷、機體免疫異常、胰島素抵抗、胎盤缺血、氧化應激等[4-5]。有研究顯示，胎盤滋養細胞增殖、凋亡與胎盤形成、胚胎生長發育密切相關，在胚胎著床后來自于絨毛末端的細胞滋養細胞進行增殖，其經增殖作用所產生的滋養細胞在蛻膜基底層固定后侵入至蛻膜螺旋動脈中，參與血管重塑的過程，最終建立起正常的子宮胎盤血供[6]。但在胎盤滋養細胞出現異常的增殖和凋亡時，會在一定程度上損傷正常的子宮胎盤血供，進而作用于子宮胎盤循環、阻礙胎盤形成，最終導致妊娠期高血壓、胎兒生長受限的發生[7-8]。綜合上述分析，胎盤滋養細胞增殖、凋亡與妊娠期高血壓密切相關，可能改善異常增殖、凋亡來改善妊娠期高血壓癥狀，本研究分析沉默miR-26b對妊娠期高血壓胎盤滋養細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響，以改善胎盤滋養細胞增殖、凋亡異常行為，修復損傷的胎盤組織。

微小RNA是近年來發現的長度大約為22nt的內源性非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于多種生物體中，經過與靶mRNA的堿基產生特異性配對作用而發揮其降解靶mRNA、抑制翻譯的作用，經上述作用后調控基因轉錄后的表達，參與機體一系列生理病理過程，包括細胞生物學行為(生長、增殖、凋亡)、惡性腫瘤、炎癥性疾病、內分泌疾病等[9-10]。miR-26b屬于微小RNA家族成員之一，其定位于CTDSP1基因的第4個內含子區域，無獨立的啟動子，其廣泛表達與腫瘤細胞、脂肪細胞、絨毛外滋養層細胞等多種細胞中，目前已經證實miR-26b參與惡性腫瘤發生、子癇前期的發生發展中[11-13]。冀琛[14]在其研究中發現，妊娠期高血壓疾病患者血清miR-26b表達量升高。魏娜等[15]均在其研究中發現，miR-26b在妊高癥患者胎盤中高表達。基于此，本文研究了沉默miR-26b對胎盤滋養細胞凋亡的影響，結果發現沉默miR-26b后發現胎盤滋養細胞凋亡明顯被抑制，而增殖率明顯增加，此結果提示著，miR-26b可能經誘導胎盤滋養細胞凋亡、增殖異常發揮促進妊娠期高血壓發生的作用，沉默其表達可改變上述異常情況，最終發揮其改善妊娠期高血壓癥狀的作用。

PI3K/Akt通路在臨床上被認為是調控細胞增殖、凋亡的經典信號通路之一，PI3K由一個催化亞單位p110和調節亞單位p85所組成的磷脂激酶，其具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。Akt為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其與蛋白激酶C、蛋白激酶A具有較高的同源性，在臨床上被稱為蛋白激酶B[16-18]。PI3K是生長因子所激活的RTKs和GPCRs重要的下游信號分子，當其被活化后會激活Akt，促使磷酸化的Akt生成，而被活化的Akt經一系列的級聯結果參與細胞增殖、凋亡過程[19-21]。本研究結果顯示，經miR-26b沉默處理的細胞，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達量升高，Bax蛋白表達量降低，此結果提示著，miR-26b沉默可能經激活PI3K/Akt通路發揮其抑制妊娠期高血壓胎盤滋養細胞凋亡，促進增殖的作用。

綜上所述，miR-26b沉默處理的妊娠期高血壓胎盤滋養細胞凋亡明顯被抑制，增殖率增加，其作用機制可能與激活PI3K/Akt通路相關。