茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境中真菌菌群多樣性分析

黎瑤依，胡小霞，黃永光*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

醬香型白酒釀造是一個(gè)固態(tài)、開(kāi)放式多菌群、菌種共同發(fā)酵的過(guò)程，其釀造環(huán)境中微生物對(duì)醬香型白酒品質(zhì)的形成密切相關(guān)。在釀造過(guò)程中，一方面，高溫大曲制作及其貯存、酒醅攤晾堆積過(guò)程和入窖發(fā)酵等生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)釀造環(huán)境微生物進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，從而形成特定的釀造環(huán)境微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)特征[1]；另一方面，環(huán)境中的部分微生物在釀造過(guò)程中會(huì)自然遷徙，接種至堆積酒醅、貯存大曲中，再參與到白酒的釀造過(guò)程，并在其中增殖、代謝，生成各種風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)醬香型白酒品質(zhì)的形成起到?jīng)Q定性作用[2-3]。因此，對(duì)釀造環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，有助于進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境與釀造過(guò)程中微生物之間的相關(guān)性，對(duì)醬香型白酒的釀造機(jī)制認(rèn)識(shí)具有重要意義。

真菌作為醬香型白酒糖化發(fā)酵過(guò)程中重要的功能微生物，在釀造過(guò)程中主要提供酶動(dòng)力、發(fā)酵動(dòng)力，對(duì)基酒的質(zhì)量具有重要調(diào)控作用。其中，霉菌能分泌多種水解酶類，分解釀造原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，同時(shí)也為其他微生物的生長(zhǎng)、代謝提供營(yíng)養(yǎng)和基礎(chǔ)物質(zhì)，對(duì)白酒酒體風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)[4-5]。而酵母菌是醬香型白酒釀造過(guò)程重要的產(chǎn)香微生物類群，直接關(guān)系到出酒率及微量香氣成分的形成，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的各種風(fēng)味物質(zhì)對(duì)醬香型白酒香氣的形成起至關(guān)重要的作用[6]。霉菌和酵母菌是影響傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒釀造過(guò)程的重要釀造微生物菌群，保證了發(fā)酵過(guò)程的正常進(jìn)行，而菌群結(jié)構(gòu)內(nèi)部彼此之間可能相互促進(jìn)，也可能相互抑制，其不同的菌群組成結(jié)構(gòu)會(huì)影響醬香型白酒的風(fēng)格和酒質(zhì)的優(yōu)劣。黃永光等[7]通過(guò)研究茅臺(tái)酒發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)微生物經(jīng)過(guò)遺傳、變異、消長(zhǎng)和衍化等微生物群落的演替，促成了耐高溫、耐高乙醇含量、耐高酸度的極端釀造微生物生態(tài)環(huán)境。張文平[8]研究發(fā)現(xiàn)醬香型白酒在釀造過(guò)程中很大一部分微生物來(lái)自空氣。羅方雯等[9]通過(guò)對(duì)釀造環(huán)境及大曲中酵母的多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境是醬香型白酒釀造過(guò)程中重要的微生物來(lái)源。Wang Xueshan等[10]采用高通量測(cè)序結(jié)合多相代謝產(chǎn)物目標(biāo)分析方法，研究中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程中老廠及新廠兩個(gè)環(huán)境中微生物的演替和代謝變化，并應(yīng)用SourceTracker軟件評(píng)價(jià)環(huán)境微生物對(duì)發(fā)酵的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)境微生物群是發(fā)酵菌群的重要來(lái)源，在白酒釀造過(guò)程中可以驅(qū)動(dòng)微生物的演替和代謝。上述文獻(xiàn)均表明參與釀造過(guò)程的微生物與釀造環(huán)境及其內(nèi)在微生物都存在密切的關(guān)聯(lián)，因此解析釀造環(huán)境中的微生物菌群結(jié)構(gòu)對(duì)認(rèn)識(shí)其生物學(xué)科學(xué)機(jī)制、提升釀造質(zhì)量具有舉足輕重的作用。目前，雖然對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程大曲、酒醅中微生物研究較多，但對(duì)釀造環(huán)境中的微生物，尤其是對(duì)醬香型白酒不同輪次釀造環(huán)境中真菌的系統(tǒng)性研究較少。因此，為進(jìn)一步探究環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)對(duì)醬香型白酒釀造品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)以茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境中真菌菌群結(jié)構(gòu)為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件，全面解析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其量化結(jié)果，旨在對(duì)科學(xué)認(rèn)識(shí)釀造環(huán)境微生物及其發(fā)酵機(jī)制、資源價(jià)值評(píng)價(jià)等提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、上坪村、椿樹(shù)村、巖灘村、向陽(yáng)村、盧榮壩村及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)等醬香型白酒主釀區(qū)域的17 個(gè)代表性釀酒企業(yè)，采樣時(shí)間2018年1—9月，共計(jì)7 個(gè)輪次，每輪次對(duì)釀造環(huán)境進(jìn)行一次采樣。環(huán)境樣品采集包括：企業(yè)生產(chǎn)車間的晾堂、墻角地面土塵、灰塵，窗戶玻璃、窗臺(tái)、墻體表面的灰塵、粉塵，車間外地面、溝渠表面土質(zhì)粉塵等，對(duì)各采樣點(diǎn)均進(jìn)行標(biāo)記固定、定期（1 個(gè)月的富集時(shí)間）、定量采集樣品。從17 個(gè)釀造企業(yè)釀造環(huán)境中共采集119 個(gè)環(huán)境樣品，按照區(qū)域劃分將每個(gè)酒企的樣品等量混合后代表一個(gè)區(qū)域的最終混合樣品，7 個(gè)輪次共計(jì)49 個(gè)環(huán)境區(qū)域混合樣品，再將49 個(gè)環(huán)境區(qū)域混合樣品按照輪次等量均值混勻得到每輪次最終混合樣品，各企業(yè)每輪次采集混合樣500 g。樣品采集后立即裝袋密封，24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室分析，采集樣品均在-80 ℃密封保存、備用。

DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A?.Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TAE（Tris acetate-EDTA）緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及DNA提取[11-12]

分別取充分混勻的綜合樣各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理結(jié)束后立即對(duì)各樣品中的微生物總DNA進(jìn)行提取，并置于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〔襟E參見(jiàn)E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的操作說(shuō)明。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq測(cè)序

應(yīng)用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3’）擴(kuò)增高變區(qū)。PCR體系及反應(yīng)條件見(jiàn)黃蘊(yùn)利等[13]的方法；每個(gè)樣本做3 次重復(fù)。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。

構(gòu)建文庫(kù)步驟：1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：

1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列。

2）barcode需精確匹配，引物允許2 個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基。

3）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap需大于10 bp。去除無(wú)法拼接的序列。使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，真菌與數(shù)據(jù)庫(kù)unite7.0/its_fungi進(jìn)行對(duì)比，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

4）采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析，AI作圖工具、R語(yǔ)言繪制氣泡圖和Upset plot圖，Cytoscape軟件繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌群多樣性分析

常用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和覆蓋率描述微生物群落物種α多樣性，可對(duì)群落物種組成的豐富度及均勻度進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。其中，Shannon指數(shù)表示群落多樣性；Chao指數(shù)和ACE指數(shù)表示群落物種豐富度。表1結(jié)果表明，各輪次樣品的覆蓋率均在99.90%以上，各樣品文庫(kù)的覆蓋率足夠大，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能體現(xiàn)環(huán)境樣品真菌菌群多樣性的真實(shí)情況。不同輪次環(huán)境樣品在97%水平下共得到294 個(gè)OTU，3輪次的OTU數(shù)最高（231），1輪次和7輪次的OTU數(shù)較中間輪次低。

表1 不同輪次環(huán)境樣品真菌的α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity of fungi in environment samples from different rounds

3、4、5 輪次樣品的Shannon指數(shù)高于1、2、6、7輪次，表明3、4、5輪次釀造期間釀造環(huán)境中真菌多樣性均高于其他輪次。生產(chǎn)實(shí)踐表明，3、4、5輪次也是醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的“大回酒”輪次，其為產(chǎn)量最高、質(zhì)量最優(yōu)的3 個(gè)輪次，說(shuō)明釀造產(chǎn)量、質(zhì)量與微生物的多樣性存在關(guān)聯(lián)。而1～7輪次的真菌ACE指數(shù)和Chao指數(shù)之間存在部分無(wú)規(guī)律現(xiàn)象，說(shuō)明不同釀造輪次環(huán)境條件的差異導(dǎo)致真菌物種豐富度出現(xiàn)變化。進(jìn)一步表明當(dāng)溫度、天氣等環(huán)境因素發(fā)生變化時(shí)，真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)可能會(huì)相應(yīng)發(fā)生一些變化。環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性會(huì)直接影響堆積發(fā)酵和大曲制作過(guò)程從環(huán)境中富集的微生物結(jié)構(gòu)及其質(zhì)量，進(jìn)而影響堆積發(fā)酵和大曲的微生物結(jié)構(gòu)優(yōu)化，這為釀造生產(chǎn)提出更嚴(yán)格的生產(chǎn)調(diào)控要求。

2.2 釀造環(huán)境中真菌菌群結(jié)構(gòu)特征

為了更加深入揭示茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒各輪次釀造環(huán)境樣品在各分類學(xué)水平上的組成情況，對(duì)不同釀造輪次環(huán)境樣品中真菌菌群結(jié)構(gòu)的門水平、屬水平特征進(jìn)行分析。從1～7輪次環(huán)境真菌樣品中共檢測(cè)到4 個(gè)真菌門，根據(jù)各菌門的相對(duì)豐度，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒各輪次釀造環(huán)境的優(yōu)勢(shì)真菌門。1～7輪次釀造過(guò)程中，Ascomycota的相對(duì)豐度呈逐漸減小趨勢(shì)變化，Basidiomycota的相對(duì)豐度則逐漸增大。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，Ascomycota不僅是醬香型白酒中優(yōu)勢(shì)真菌種群[14]，同樣也是濃香[15]、清香型白酒[16]及食醋[17]等多種發(fā)酵食品生產(chǎn)中的主要真菌菌群。

同時(shí)，從茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7 個(gè)釀造輪次的環(huán)境樣品中共檢出212 個(gè)真菌屬。根據(jù)平均相對(duì)豐度將樣本中菌屬分為優(yōu)勢(shì)菌屬（平均相對(duì)豐度≥1%）和次要菌屬（平均相對(duì)豐度＜1%），且將次要菌屬歸類于其他（others）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，平均相對(duì)豐度≥1%的菌屬有14 個(gè)，分別為節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）22.87%、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）20.55%、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）11.71%、曲霉屬（Aspergillus）10.9%、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）6.22%、熱子囊菌屬（Thermoascus）4.84%、隱球酵母屬（Cryptococcus）4.47%、unclassified_f__Saccharomycetaceae 2.72%、紅酵母屬（Rhodotorula）1.93%、枝孢屬（Cladosporium）1.81%、Rasamsonia1.58%、絲衣霉屬（Byssochlamys）1.46%、unclassified_o__Eurotiales 1.24%和毛孢子菌屬（Trichosporon）1.10%。由圖1可知，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒各輪次釀造環(huán)境真菌以Wallemia和Saccharomycopsis為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。Liu Maoke等[18]利用變性梯度凝膠電泳和Illumina MiSeq測(cè)序方法對(duì)濃香型白酒發(fā)酵窖泥中真菌群落進(jìn)行分析，同樣得出Wallemia是濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。Saccharomycopsis是酒藥香氣的主要產(chǎn)生菌，該菌屬在黃酒釀造和以大米為原料的釀造酒生產(chǎn)過(guò)程對(duì)發(fā)酵具有重要作用[19]，同時(shí)也在濃香型白酒發(fā)酵酒醅中檢出[20]。Wickerhamomyces是白酒發(fā)酵過(guò)程高產(chǎn)乙醇生產(chǎn)者，從感官評(píng)價(jià)看，其參與生產(chǎn)的白酒風(fēng)味較和諧、花香值較高[21-22]。羅方雯等[23]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)解析茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境及大曲中的酵母菌群多樣性結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Saccharomycopsis和Wickerhamomyces是釀造環(huán)境的優(yōu)勢(shì)酵母屬，環(huán)境是醬香型白酒釀造過(guò)程生產(chǎn)大曲中的酵母屬的主要來(lái)源。朱治宇等[24]通過(guò)對(duì)不同輪次釀造環(huán)境和大曲中可培養(yǎng)霉菌多樣性結(jié)構(gòu)分析，得出Aspergillus等霉菌屬是醬香型白酒釀造環(huán)境中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌。由此可見(jiàn)，釀造環(huán)境中的微生物通過(guò)大曲富集及堆積發(fā)酵進(jìn)而遷徙進(jìn)入到釀造過(guò)程，為酒醅發(fā)酵提供了微生物來(lái)源。Aspergillus是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，在白酒釀造過(guò)程主要作用于發(fā)酵前期，是釀造霉菌中種類最多的真菌屬[25]。由于醬香型白酒釀造環(huán)境酸度較高，曲霉分泌的酸性水解酶能分解原料中的纖維素與淀粉質(zhì)大分子物質(zhì)，催化促成芳香脂類物質(zhì)的產(chǎn)生，在醬香型白酒中具有提升、改善酒體風(fēng)味的作用[26-27]。王雪山[28]對(duì)清香型白酒發(fā)酵環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)清香型白酒釀造環(huán)境中真菌種群主要有Pichia、Saccharomycopsis、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Aspergillus。結(jié)合上述等其他研究者的結(jié)論和本研究結(jié)論可知，絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬中Saccharomycopsis不僅是醬香型白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)微生物，也是其他香型白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)微生物，但醬香型白酒在微生物結(jié)構(gòu)組成上又有別于其他香型，這是因?yàn)獒u香型白酒釀造過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物的種類和豐度遠(yuǎn)高于其他香型環(huán)境微生物。

圖1 釀造環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖（前14 個(gè)）Fig.1 Distribution of fungal community structure in brewing environment (top 14 most abundant genera)

為進(jìn)一步解析各輪次釀造環(huán)境中的微生物菌群結(jié)構(gòu)特征，對(duì)屬水平上主要真菌的分布差異進(jìn)行分析，將上述優(yōu)勢(shì)菌屬在各輪次中相對(duì)豐度最高的菌屬作為該輪次的標(biāo)志性真菌屬。1輪次的標(biāo)志性菌屬是Thermoascus（29.64%），但在2輪次急劇下降至1.78%，后又緩慢下降至7輪次時(shí)為0.05%。Thermoascus在前3 個(gè)輪次的環(huán)境樣品中的相對(duì)豐度較高，隨著生產(chǎn)輪次推進(jìn)其相對(duì)豐度呈逐漸降低趨勢(shì)，其原因可能是前3 個(gè)輪次釀造環(huán)境適宜Thermoascus的生長(zhǎng)，而從4輪次開(kāi)始，釀造環(huán)境溫度等理化性質(zhì)發(fā)生了一定的改變，使得該菌的生長(zhǎng)受限從而導(dǎo)致豐度呈持續(xù)下降趨勢(shì)。Thermoascus能產(chǎn)木聚糖酶、超氧化物歧化酶、角質(zhì)酶等熱穩(wěn)定的水解酶類，這些酶類在堆積糖化發(fā)酵以及對(duì)醬香風(fēng)味的形成起重要的作用[29-30]。Saccharomycopsis是3、4輪次的標(biāo)志性菌屬，該菌屬在1輪次的相對(duì)豐度為16.75%，2輪次時(shí)上升至40.27%，3、4輪次期間Saccharomycopsis相對(duì)豐度變化不大（40.27%～41.53%），5輪次時(shí)又急劇下降至4.95%，到7輪次時(shí)下降至1.25%。5～7輪次為茅臺(tái)鎮(zhèn)一年中環(huán)境溫度最高的3 個(gè)輪次，因此，Saccharomycopsis的生長(zhǎng)可能對(duì)釀造環(huán)境溫度有一定的要求，并且有資料表明該菌屬對(duì)白酒香氣物質(zhì)的形成具有促進(jìn)作用[31]。5、6、7輪次釀造環(huán)境的標(biāo)志性菌屬是Wallemia，該菌屬在1、2、3輪次釀造環(huán)境中相對(duì)豐度極低（小于0.02%），4輪次時(shí)大幅上升至14.05%，5輪次時(shí)又大幅上升至43.07%，后呈現(xiàn)小幅波動(dòng)至7輪次時(shí)的54.33%。

上述結(jié)果表明，不同輪次環(huán)境樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬的組成結(jié)構(gòu)相似度較高，但其各輪次的標(biāo)志性真菌屬存在差異，說(shuō)明釀造環(huán)境微生物中的標(biāo)志性真菌屬隨釀造時(shí)空徑向的變化而變化，這與具體微生物、環(huán)境條件之間的相互作用有關(guān)，具體機(jī)制正在進(jìn)一步研究。茅臺(tái)鎮(zhèn)傳統(tǒng)醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程的發(fā)酵溫度較高，同時(shí)茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境的季節(jié)性溫度也高，自然環(huán)境中微生物受到的影響也較大。因此，不同輪次之間釀造環(huán)境微生物存在的差異仍然會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)及演替的變化，還可能導(dǎo)致大曲貯存過(guò)程、酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程從釀造環(huán)境富集微生物的差異。

2.3 釀造環(huán)境中真菌菌群結(jié)構(gòu)差異性

為進(jìn)一步分析不同輪次環(huán)境樣品中真菌菌群的共性和差異性特征，利用Upset plot解析各釀造輪次環(huán)境樣本中真菌菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上所共有和獨(dú)有的屬水平數(shù)目，可直觀表征環(huán)境樣本中真菌屬水平共有的重疊情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 釀造環(huán)境中真菌Upset plot分析（屬水平）Fig.2 Upset plot analysis of fungi in brewing environment at genus level

由圖2左側(cè)條形圖可知，各輪次真菌種類差異性不大，其中6輪次真菌種類最多，7輪次真菌種類最少。右側(cè)Upset plot表明，7 個(gè)輪次共有相同真菌屬56 個(gè)，共有屬的相對(duì)豐度和在1～7輪次的占比分別為99.02%、99.34%、96.75%、99.80%、99.64%、98.96%和99.84%。從共有屬相對(duì)豐度和占比結(jié)果表明，7 個(gè)輪次釀造環(huán)境中的主要微生物具有較好的相對(duì)穩(wěn)定性特征，這有利于釀造環(huán)境微生物資源的保護(hù)與利用。各輪次特征性真菌屬（只有該輪次才出現(xiàn)的真菌屬）種類相對(duì)比較豐富，其中6輪次檢出的特征性真菌屬最多，為20 個(gè)，占該輪次總真菌屬數(shù)量的13.60%；5輪次檢測(cè)出的特征性真菌屬最少，為3 個(gè)，占該輪次總真菌屬數(shù)量的2.59%；說(shuō)明不同微生物在各輪次的占比直接調(diào)控不同輪次的發(fā)酵特征和酒體風(fēng)格質(zhì)量。在整個(gè)生產(chǎn)年度中，1輪次起始時(shí)發(fā)現(xiàn)116 個(gè)真菌屬到7輪次時(shí)剩余66 個(gè)真菌屬（相對(duì)豐度和占99.02%），消亡率為0.98%。有32 種真菌在1輪次未發(fā)現(xiàn)或相對(duì)豐度低于檢出限，但在7輪次時(shí)檢出，其相對(duì)豐度和占比0.16%，有27 種真菌僅出現(xiàn)在2～6輪次，其相對(duì)豐度和占比分別為0.03%、0.03%、0.03%、0.01%和0.04%，只有49 種真菌單獨(dú)出現(xiàn)在1～7輪次中，剩余的163 種真菌屬具有輪次間的傳承性。

綜上所述，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境中各輪次真菌之間存在一定的共性特征，且共有真菌種類的穩(wěn)定性較好，數(shù)量和種類上都具有傳承性。同時(shí)，特征性真菌屬種類較豐富，說(shuō)明各個(gè)輪次釀造環(huán)境真菌存在的差異性也可為醬香型白酒生產(chǎn)提供更加豐富的菌種資源。

2.4 核心真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造過(guò)程環(huán)境中真菌種類繁多，相互關(guān)系復(fù)雜。相關(guān)研究表明[32-34]，平均相對(duì)豐度大于1%且至少出現(xiàn)在一個(gè)樣品以上的菌屬被定義為核心菌屬。核心微生物群是白酒生產(chǎn)過(guò)程中最重要的微生物屬，占主導(dǎo)地位[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，茅臺(tái)鎮(zhèn)7 個(gè)釀造輪次釀造環(huán)境樣品中的核心菌屬有12 個(gè)，分別為Saccharomycopsis、Thermoascus、Wallemia、Wickerhamomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Cryptococcus、unclassified_f__Saccharomycetaceae、Rhodotorula、Cladosporium、Rasamsonia和unclassified_o__Eurotiales。為深入挖掘特定環(huán)境中復(fù)雜微生物群落物種之間相關(guān)性，系統(tǒng)認(rèn)識(shí)核心真菌菌群之間的相互關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，通過(guò)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析探討相關(guān)性較強(qiáng)真菌屬間的相互作用，將12 種核心真菌屬進(jìn)行物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 環(huán)境樣品中的核心真菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig.3 Correlation network diagrams of core fungal community in brewing environment at genus level

如圖3所示，得到22 個(gè)節(jié)點(diǎn)和42 條邊，總體上真菌屬之間的相互關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，連接線縱橫密集分布，真菌的正相關(guān)連接邊比負(fù)相關(guān)多。與Ascomycota最強(qiáng)節(jié)點(diǎn)為Debaryomyces，與Basidiomycota最強(qiáng)節(jié)點(diǎn)為Rhodotorula。高相關(guān)性節(jié)點(diǎn)是指與一定數(shù)量的其他微生物均有相關(guān)性的一類微生物，也稱為Hub節(jié)點(diǎn)[36]。從Hubs種類及數(shù)量在一定程度上可反映特定環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從圖3a發(fā)現(xiàn)8 個(gè)Hubs（指至少與其他4 個(gè)屬的微生物存在正相關(guān)節(jié)點(diǎn)），Cladosporium是Ascomycota下的枝孢菌屬，與Aspergillus、Debaryomyces、Saccharomycopsis、Rhodotorula、unclassified_f__Saccharomycetaceae和Wallemia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。unclassified_o__Eurotiales與Aspergillus、Saccharomycopsis、Debaryomyces、Thermoascus和Rasamsonia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Basidiomycota下的Rhodotorula與Aspergillus、Debaryomyces、Saccharomycopsis、Cladosporium和unclassified_f__Saccharomycetaceae顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Saccharomycopsis與unclassified_o__Eurotiales、Rasamsonia、Thermoascus和Debaryomyces顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Debaryomyces與Aspergillus、Thermoascus和Rasamsonia顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Thermoascus與Aspergillus和Rhodotorula顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Cryptococcus、Wickerhamomyces與Debaryomyces顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Wallemia、unclassified_f__Saccharomycetaceae與Aspergillus和Cladosporium顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

從圖3b可發(fā)現(xiàn)，unclassified_f__Saccharomycetaceae、Thermoascus和Rasamsonia3 個(gè)負(fù)相關(guān)Hubs（指至少與其他4 個(gè)屬的微生物存在負(fù)相關(guān)節(jié)點(diǎn)）。unclassified_f__Saccharomycetaceae與Debaryomyces、unclassified_o__Eurotiales、Thermoascus、Rasamsonia和Saccharomycopsis顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Thermoascus與Wallemia、Cladosporium和Rhodotorula顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Rasamsonia與Rhodotorula、Cladosporium、unclassified_f__Saccharomycetaceae和Aspergillus顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Cladosporium與unclassified_o__Eurotiales顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。unclassified_o__Eurotiales與Rhodotorula顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Aspergillus與Saccharomycopsis顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Debaryomyces與Wallemia顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

綜上所述，通過(guò)正、負(fù)相關(guān)關(guān)系，真菌菌群之間形成相互影響的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。根據(jù)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知，在核心真菌菌屬之間直接或間接影響彼此生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而對(duì)釀造微生物體系平衡的維持或者破壞產(chǎn)生一定的影響。這些相互生物學(xué)關(guān)系構(gòu)成了釀造過(guò)程的基本生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，也是釀造過(guò)程發(fā)酵動(dòng)力、風(fēng)味動(dòng)力形成和調(diào)控機(jī)制的基本組成，復(fù)雜的共生關(guān)系和拮抗關(guān)系形成了穩(wěn)定的釀造環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，這也是釀造過(guò)程微生物菌群穩(wěn)定性和演替的內(nèi)在調(diào)控動(dòng)力和機(jī)制。從核心菌屬之間的相關(guān)性結(jié)果表明，環(huán)境中穩(wěn)定的微生物菌群結(jié)構(gòu)為釀造過(guò)程提供了豐富的微生物來(lái)源以及穩(wěn)定的釀造產(chǎn)質(zhì)量。正是因?yàn)楹诵木褐g形成的共生、拮抗等生物學(xué)關(guān)系，才能維持整個(gè)釀造體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展，推進(jìn)釀造進(jìn)程沿襲乙醇發(fā)酵和風(fēng)味富集方向發(fā)展。

3 結(jié) 論

通過(guò)高通量測(cè)序方法，對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)2017—2018釀造年度1～7輪次環(huán)境樣品進(jìn)行了真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及特征性分析和研究。結(jié)果表明，從釀造環(huán)境樣品中共檢出4 個(gè)真菌門，212 個(gè)真菌屬。根據(jù)各菌門、屬的相對(duì)豐度，Ascomycota和Basidiomycota是茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒各輪次釀造環(huán)境樣品的優(yōu)勢(shì)菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬主要有Wickerhamomyces、Aspergillus等14 個(gè)，其中Wallemia和Saccharomycopsis為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。通過(guò)對(duì)真菌屬水平分布差異分析，發(fā)現(xiàn)不同輪次釀造環(huán)境樣品中真菌組成相似度較高，但其各輪次標(biāo)志性真菌屬存在差異。結(jié)合Upset plot對(duì)各輪次間釀造環(huán)境樣品中共有真菌及特征性真菌結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行分析，7 個(gè)輪次共有相同真菌屬56 個(gè)，且均在各輪次占主導(dǎo)地位，特征性真菌屬在各輪次中相對(duì)豐度和占比較小但種類豐富。對(duì)12 個(gè)核心菌屬進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)8 個(gè)正相關(guān)Hubs以及3 個(gè)負(fù)相關(guān)Hubs，Ascomycota最強(qiáng)節(jié)點(diǎn)為Debaryomyces，Basidiomycota最強(qiáng)節(jié)點(diǎn)為Rhodotorula，正相關(guān)性比負(fù)相關(guān)性強(qiáng)，復(fù)雜的共生關(guān)系和拮抗關(guān)系是釀造過(guò)程微生物菌群穩(wěn)定性和演替的內(nèi)在調(diào)控動(dòng)力和機(jī)制，環(huán)境中穩(wěn)定的微生物菌群結(jié)構(gòu)為釀造過(guò)程提供了豐富的微生物來(lái)源，保障了各輪次的正常生產(chǎn)釀造。通過(guò)研究茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境中真菌多樣性及特征規(guī)律，進(jìn)一步揭示了茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境微生物與釀造過(guò)程微生物之間的相關(guān)性機(jī)制。