外源茉莉酸甲酯對鹽脅迫下玉米幼苗AsA-GSH循環的影響*

陳 芳 楊雙龍 張 莉 佟祎鑫 張志華 虞凡楓 賈凌云**

（1 西北師范大學生命科學學院中心實驗室 甘肅蘭州 730070 2 云南師范大學生命科學學院生化實驗室 云南昆明 650501）

土壤鹽漬化對農業生產有極大滯礙作用，我國鹽漬化土地的總面積約占全國可利用土地面積的4.88%（約1 億hm2），且每年約有0.83%的農耕土地發生次鹽漬化[1-2]。尤其是我國西部干旱荒漠地區，土地鹽漬化尤為嚴重，對當地農業生產和生態環境造成了較為嚴重的損害。

玉米（Zea maysL.）作為一種喜溫農作物，具有品質好、產量高、適應能力較強等特點[3]，玉米的大量種植也是解決我國糧食問題的有效手段之一。近年來，隨著我國農業技術的發展和種植方式的不斷改進，玉米的栽培面積逐年地增加，玉米的產量和品質也有較大的提高，使我國玉米總的種植面積僅次于水稻（Oryza sativaL.）和小麥（Triticum aestivumL.），約為2 000 萬hm2[4-5]。有研究表明，土壤鹽漬化會導致玉米的產量嚴重受損[1-2]，緩解鹽脅迫對植物造成傷害的相關研究迫在眉睫。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonat，MeJA）是一種普遍存在于植物體內的重要激素和信號分子，參與植物抗逆反應的眾多調控過程[6-8]。已有研究表明，施加MeJA 能降低鹽脅迫對植株造成的損傷，從而使其抵抗逆境的能力升高[6,9-10]。龐延軍等[11]通過研究表明，一定質量濃度的外源MeJA 可使鹽脅迫下水稻種子萌發率明顯的提高。而Yoon等[12]研究發現，對鹽脅迫下的大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］外源施加MeJA，增加了其脯氨酸的含量，降低植株的光合速率，表明外源施加MeJA能減小鹽脅迫對大豆造成的傷害。

已有研究證實，植物受到逆境脅迫時，其體內的抗氧化劑含量及抗氧化物酶的活性會發生相應的變化，以強化其抗氧化代謝循環的水平，優化植物活性氧的解毒體系，最終提高植物抵抗逆境的能力［13］。現有研究主要關注MeJA 對鹽脅迫下水稻、大豆等植物抗氧化能力的影響，而對于玉米抗鹽脅迫的相關研究較少。研究顯示，外源MeJA 對于滲透脅迫下的玉米幼苗具有一定的調節作用[14]，但外源MeJA 對鹽脅迫下玉米幼苗的抗氧化能力影響的研究尚未見報道。本實驗通過對短期鹽脅迫下的玉米幼苗根系外源施加75 μmol/L MeJA，探究其對150 mmol/L NaCl 脅迫下玉米幼苗抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究實驗材料為“農星-207”玉米種子，選購于山東淄博公司。

1.2 材料及培養 選取“農星-207”玉米種子（籽粒飽滿），用自來水清洗3～5 次，洗去包衣。用1.5%的CuSO4溶液（稱取1.5 g CuSO4溶于100 mL蒸餾水）浸泡消毒10 min 后，再用蒸餾水沖洗2～3 次，浸泡24 h。將浸泡好的種子均勻播種至鋪有6 層濾紙的白瓷盤上，用蒸餾水潤濕后蓋上蓋子，期間連續補給適量蒸餾水，注意不能超過種子的2/3。置于溫度為28℃培養箱中暗培養60 h，待種子萌發出芽并長至3～4 cm（胚芽鞘）高時，進行相應的處理。

玉米種子的處理參照楊雙龍等[15]的方法。萌發60 h 后，將實驗材料進行3 種處理：1）蒸餾水培養的對照組（CK）；2）150 mmol/L NaCl 鹽脅迫實驗組（N）；3）鹽脅迫外施75 μmol/L MeJA 實驗組（N+M）。處理前取樣一次，以后各組每隔24 h 取一次樣，共取5 次，每次實驗取3 組樣，每組實驗取3 個重復。每個重復各稱取玉米胚芽鞘0.1 g，裝在2 mL 離心管中，經液氮速凍后，在-80℃冰箱保存。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 氧化物質含量的測定 還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、按還原型抗壞血酸（AsA）含量的測定按照購買的試劑盒（蘇州科銘）說明書進行。

1.3.2 抗氧化酶活性測定 抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定按照購買的試劑盒（蘇州科銘）說明書進行。

1）APX 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下催化1 μmol AsA，即為1 個酶活力單位（1 U）。

2）DHAR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下形成1 nmol AsA，即為1 個酶活力單位（1 U）。

3）MDHAR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下催化1 nmol NADH，即為1 個酶活力單位（1 U）。

4）GR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃、pH 值為8.0 的條件下氧化1 nmol NADPH，即為1 個酶活力單位（1 U）。

1.4 數據分析 將實驗數據統計整理后，用SPSS 19.0 軟件和Duncan 氏新復極差法進行多重比較分析數據，用GraphPad Prism8.4.3 進行圖表繪制，圖中以不同小寫字母表明在P＜0.05 水平上有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘AsA 含量的影響 由圖1 可知，鹽脅迫處理的實驗組提高了AsA 的含量，24 h 時較對照升高了51.4%（P＜0.01），96 h 時升高了42.2%（P＜0.01），說明鹽脅迫促使AsA 含量提高。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理進一步提高了AsA 含量，在處理24 h時相比對照增加56.9%（P＜0.01），96 h 時增加了55.6%（P＜0.01）。鹽脅迫下MeJA 處理與單獨的NaCl 脅迫處理相比，在24 h 時分別增加3.7%，96 h 時增加7.7%，表明鹽脅迫組在施加外源MeJA后，玉米胚芽鞘中AsA 含量顯著升高。

圖1 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型抗壞血酸（AsA）含量的影響

2.2 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘中AsA 代謝酶（APX、DHAR、MDHAR）活性的影響 由圖2可知，與對照組相比，單獨的鹽脅迫處理下APX活性隨脅迫時間的延長呈現升高趨勢，在96 h 時其活性提高了71.0%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理，APX 活性也呈升高趨勢，在處理96 h時其活性與對照組相比提高了91.0%（P＜0.01），表明施加MeJA 促進了鹽脅迫下玉米胚芽鞘中APX活性的提高。

圖2 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的影響

由圖3 可知，在96 h 時單獨的鹽脅迫處理下，DHAR 活性提高，相比對照組提高了179.8%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加MeJA 處理進一步提高了DHAR 活性，在處理96 h 時相比對照組提高了233.5%（P＜0.01），相比單獨的鹽脅迫處理提高19.2%，表明75 μmol/L MeJA 處理促進了玉米胚芽鞘中DHAR 活性的提高。

圖3 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的影響

由圖4 可知，單獨的鹽脅迫處理下MDHAR 活性顯著提高，在96 h 時相比對照組提高了34.6%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理進一步提高了MDHAR 的活性，在處理96 h 時相比對照組提高了54.2%（P＜0.01），相比單獨的鹽脅迫處理提高了14.6%，表明75 μmol/L MeJA 處理促進了玉米胚芽鞘中MDHAR 活性的提高。

圖4 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性的影響

2.3 MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH 含量影響

由圖5 可知，單獨的鹽脅迫處理相比對照組提高了GSH 的含量，在96 h 時升高了36.7%（P＜0.01），說明鹽脅迫促進了GSH 含量的提高。鹽脅迫下施加外源MeJA 后進一步提升了GSH 含量，在96 h 時相比對照組增加了86.1%（P＜0.01），表明外源施加MeJA處理促進了玉米胚芽鞘中GSH含量的提高。

圖5 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型谷胱甘肽（GSH）含量的影響

2.4 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值的影響 圖6 顯示，外源施加MeJA 能提高鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值，在處理96 h 時，NaCl+MeJA 處理比單獨NaCl 處理GSH/GSSG 比值提高了69.7%（P＜0.01）；同時，NaCl 處理和NaCl+MeJA 處理GSH/GSSG 比值分別比對照組提高了195.6%（P＜0.01）和401.6%（P＜0.01），表明外源施加75 μmol/L MeJA 處理下，玉米胚芽鞘細胞氧化還原力（GSH/GSSG）增強。

圖6 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型谷胱甘肽含量與氧化型谷胱甘肽含量（GSH/GSSG）比值的影響

2.5 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘中GSH 代謝酶（GR）活性的影響 由圖7 可知，單獨的NaCl脅迫處理的實驗組，在處理96 h 時與對照相比，玉米胚芽鞘中GR 活性上升了31.7%（P＜0.01）。與單獨的NaCl 處理相比，在處理96 h 時，NaCl+MeJA處理下玉米胚芽鞘中GR 活性升高了13.6%（P＜0.05），表明外源施加MeJA 能提高NaCl 脅迫下玉米胚芽鞘中GR 的活性。

圖7 外源MeJA 對鹽脅迫下玉米胚芽鞘谷胱甘肽還原酶（GR）活性的影響

3 討論

鹽脅迫會對植物細胞造成較嚴重的氧化脅迫傷害[16-17]，而在維持植物細胞的氧化還原平衡中，AsA-GSH 循環具有十分重要的作用[16]。APX 催化AsA 將H2O2轉化成H2O 和MDHA，MDHA 在MDHAR 的催化作用下轉化成AsA 或進一步生成DHA，而DHA 在DHAR 的催化作用下以GSH 為底物生成AsA，與此同時GSH 氧化成GSSG，GSSG 又可在GR 的作用下還原為GSH[18-19]。

本實驗研究表明，在人工模擬的150 mmol/L NaCl 鹽脅迫下，外源施加75 μmol/L MeJA 提高了150 mmol/L NaCl 鹽脅迫下玉米幼苗AsA-GSH 循環中抗氧化劑AsA、GSH 含量，GSH/GSSG 的比值及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，從而促進玉米幼苗抗氧化能力的提高。

有研究顯示，MeJA 可參與逆境脅迫下AsAGSH 循環的調節過程[20-22]，但對于在鹽脅迫下，MeJA 調控玉米幼苗中AsA-GSH 循環的機制目前尚不清楚。實驗探究玉米幼苗中AsA、GSH 含量變化，GSH/GSSG 比值的變化及AsA-GSH 循環中關鍵酶活性的變化，旨在闡明MeJA 調控對鹽脅迫下玉米幼苗中AsA-GSH 循環的機制的影響。

AsA 在植物細胞的抗氧化脅迫能力方面具有十分關鍵的作用，而APX、DHAR、MDHAR 及GR是AsA-GSH 循環過程中的關鍵酶[23-25]。通過研究發現，施加MeJA 促進了鹽脅迫下玉米胚芽鞘中的AsA 含量，并提高了AsA 循環中關鍵酶APX、DHAR、MDHAR 活性，表明鹽脅迫下對玉米幼苗外源施加MeJA 能提高AsA 含量，促使AsA 清除鹽脅迫下玉米幼苗中產生的過量H2O2，從而緩解鹽脅迫造成的損害。實驗結果表明MeJA 提高了玉米胚芽鞘中MDHAR 和DHAR 的活性，加速了玉米幼苗中MDHA 和DHA 的轉化，最終促使AsA 含量的增加，加速了AsA-GSH 循環。APX 活性的升高表明MeJA 加速了AsA 的轉化，但相較于MDHAR 和DHAR 活性的增幅，APX 活性升高較小，說明可能存在另一種轉化機制促使AsA 的轉化或因玉米胚芽鞘中積累過多活性氧，導致APX 活性升高的比較緩慢。

GSH 含量是AsA-GSH 循環效率高低的重要指標之一[25-26]，更為重要的是，植物細胞代謝過程中產生的活性氧（ROS）能在一定程度上被GSH 清除，從而減少由于膜脂過氧化作用對細胞造成嚴重傷害[27-28]。GSH/GSSG 比值是細胞內重要的氧化還原參數，表示細胞所處的氧化還原狀態[11]。同時，本實驗也發現150 mmol/L NaCl 脅迫使GSH含量升高，GSH/GSSG 的比值增大，而施加外源MeJA 進一步促使了玉米幼苗在鹽脅迫下GSH 含量升高及GSH/GSSG 比值的升高。與單獨鹽脅迫處理的玉米胚芽鞘相比，外源施加75 μmol/L MeJA 進一步提高了玉米胚芽鞘中AsA-GSH 循環中GR 的活性。GSH 含量升高，GSSG 含量下降，GR 活性升高，表明GSH 含量的增加主要是GSH生成量的增加；GR 活性升高，表明GSH 循環的加速，從另一方面也表明AsA 含量的增加一部分來自于GSH 循環。

綜上所述，在150 mmol/L NaCl 鹽脅迫條件下，外源施加MeJA 提高了玉米幼苗AsA-GSH 循環中抗氧化劑AsA、GSH 含量及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，加速了對活性氧的清除，從而促進玉米幼苗抗氧化能力的提高。這些結果為深入研究鹽脅迫下MeJA 調控植物抗氧化代謝提供了新的思路，也有助于探明鹽脅迫下植物維持細胞氧化還原平衡的機理。因條件限制，本實驗未從玉米胚芽鞘的質膜通透性、抗氧化酶活性等其他耐鹽生理生化指標方面做進一步探究，期待其他有興趣的研究者能進行深入研究。