蘭州百合不同外植體植物組織培養

樊敏唐亞玲王莉馬倩呂小旭徐向恩

(1.甘肅醫學院，甘肅 平涼 744000；2.平涼市藥品檢驗檢測中心，甘肅 平涼 744000)

蘭州百合(Lilium davidii var.willmottiae(E.H.Wilson)Raffill)屬于百合科百合屬單子葉多年生草本植物。蘭州百合是甘肅省蘭州市特產的地理性標志產物，其色澤潔白如玉，纖維含量較少，味道甜美，具有很高的營養價值和經濟價值[1-3]。蘭州百合是百合中的上乘之品，是全國唯一的食用甜百合[4]。蘭州百合已經成為蘭州周邊地區帶動經濟發展的主要支持產業。

現代研究發現，百合中含有甾體皂苷、生物堿、黃酮類成分、苯丙素和多糖類成分[5-10]。百合在治療疾病方面運用較廣泛，如安神助眠、止咳化痰、調節免疫系統、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌，同時還可以降低血糖濃度[10-14]。與此同時，百合還是一個藥食兩用品。而近年來，市場需求不斷增加，種植面積不斷增大，但是目前食用百合中存在種源退化嚴重、連作障礙、病害流行嚴重、育種工作落后等問題[15]，并已成為將蘭州百合推向市場走向世界的阻礙。

近年來，植物組織培養技術已日趨成熟[16-18]，通過對植物進行組織培養，篩選出最佳培養基，促進該植物規模化生產。因此，本研究通過對蘭州百合進行植物組織培養，篩選其最佳培養基、最佳消毒時間以及接種方式建立其快速繁殖體系，擴大其生產量，為蘭州百合規模化生產提供理論基礎及技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州百合新鮮鱗莖、莖、葉。

1.2 方法

1.2.1 培養基

以MS為基本培養基，設置2種不同激素濃度的培養基。

1.2.1.1 誘導愈傷組織及叢生芽培養基

MS培養基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1；MS培養基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 0.5mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1。

1.2.1.2 生根培養基

MS加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

1.2.2 外植體處理

1.2.2.1 外植體消毒

用毛刷輕輕刷去百合鱗莖、莖、葉上的泥垢后，流水沖洗30min，分別用以下2種方法進行消毒，做好標記。

75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞浸泡12min，中間換1次升汞溶液，最后在無菌室中用無菌水沖洗5～8次；漂白粉過飽和溶液上清液浸泡15min，無菌水沖洗1～2次，75%酒精浸泡1～2s，無菌水沖洗2～3次，0.1%點升汞浸泡8～10min，無菌水沖洗5～8次。

1.2.2.2 外植體接種

將上述消毒好的鱗莖縱切成0.5～1cm2小塊，近軸面分別向上、向下放置。莖橫切成段平放在培養基表面。葉切為1～2cm2小片放置在培養基上。

1.2.2.3 培養條件

溫度25±2℃，光照強度3000lx，光照周期12h/24h。

1.2.3 生根培養

待叢生芽長至3～5cm長時，將已形成的叢生芽轉接到生根培養基中，進行生根培養。培養條件，溫度27±1℃，光照強度2100～2500lx，光照周期12h/24h。約30d后統計生根率。

1.2.4 煉苗和移栽

生根培養40d左右，待幼根在培養基上長到2～3cm時，進行煉苗。先去掉瓶蓋，煉苗2～3d后用鑷子取出并用水洗凈根部的瓊脂，栽入腐殖土∶珍珠巖=1∶1的營養基質中，30d后調查成活率。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導的影響

表1 不同激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導的影響

在探究激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導的影響時，2,4-D含量過少，誘導的愈傷組織也越少，且愈傷組織生長緩慢。而使用MS加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1時，愈傷組織生長較快，且長出的愈傷組織呈瘤狀突起，愈傷組織約在30～40d后分化為叢生芽。

2.2 不同消毒方法對百合誘導愈傷組織及叢生芽的影響

從表2可以看出，外植體通過漂白粉過飽和溶液上清液處理15min，75%酒精處理2s，0.1%升汞處理9min后，污染率高達73.34%，說明消毒效果不佳，容易被污染。由此可見，最佳消毒方法為75%酒精30s加0.1%升汞10min(中間更換1次升汞溶液)。

表2 不同消毒方法對愈傷組織及叢生芽誘導的影響

2.3 不同外植體對百合愈傷組織及叢生芽誘導的影響

表3 不同外植體對愈傷組織及叢生芽誘導的影響

通過對蘭州百合不同部位進行植物組織培養，發現誘導愈傷組織誘導率順序大小為鱗莖>莖>葉片，且愈傷組織分化為叢生芽的時間也是如此，見圖1～4。在以鱗莖為外植體時，放置方式對誘導速度也有影響，近軸面向上放置能更快出現愈傷組織并分化成叢生芽。

2.4 生根培養

由于莖與葉前期愈傷組織誘導效果不佳，因此在轉接生根時將鱗莖的叢生芽轉接到生根培養基中，生根培養基為MS加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

表4 叢生芽轉接生根表

2.5 煉苗與移栽

幼根在培養基長至2～3cm長時進行煉苗并移栽，移栽入腐殖土∶珍珠巖=1∶1的營養基質中時，需加入百菌清1000倍液以及吡蟲啉1000倍液以防生蟲、生菌。移栽入營養基質中30d統計成活率時，發現移栽的幼根發育為1～2cm的小鱗莖。將已生根的131株全部移栽，成活數為106，成活率為80.92%。

3 討論

不同激素濃度對于愈傷組織的誘導具有重要影響，濃度過低誘導率低且叢生芽生長緩慢。誘導愈傷組織及叢生芽的最佳培養基為MS培養基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1。蘭州百合在接種時不同的消毒方式對愈傷組織及叢生芽的誘導影響顯著，通過對比，最佳消毒方式為75%酒精30s加0.1%升汞12min(中間換1次升汞溶液)加無菌水沖洗5～8次。不同外植體的誘導率不同，誘導率為鱗莖>莖>葉。除此之外，外植體放置時近軸面向上放置時形成愈傷組織更快。

本試驗分別以蘭州百合鱗莖、莖、葉為外植體，進行愈傷組織及叢生芽誘導、生根培養、煉苗移栽，建立蘭州百合快速繁殖體系，以期增加產量，為規模化生產奠定理論基礎。