硫氧還蛋白及硫氧還蛋白相互作用蛋白在結腸息肉癌變中的表達及意義*

楊婕琳 翟明慧 張凡 趙東強

(河北北方學院附屬第一醫院1．消化內科；2．腫瘤內科；3.病理科，河北 張家口 075000； 4.河北醫科大學第二醫院消化內科，河北 石家莊 050000)

目前，結直腸癌(colorectal cancer, CRC)已成為第三大常見的癌癥，隨著人類生活條件和環境的不斷變化，其發病率也逐年增加，且發病人群趨于年輕化[1]。手術切除仍是該病的主要治療手段，對切除的癌癥進行病理檢查是確定預后和指導輔助腫瘤治療的關鍵。研究表明，多數CRC起源于腺瘤性息肉[2]。結腸息肉是長在結腸腔內的粘膜表面的突出，在15%～20%的人群中診斷出的腸粘膜內最常見的變化，當結腸息肉大于10 mm時，發生癌變的可能性大大增加[3]。結腸息肉的病理類型與惡性病變之間密切關聯，近年來，關于結腸息肉的研究越來越受到重視，及時診斷和治療結腸息肉是控制和減少結腸癌發生的重要途徑[4]。然而，關于結腸息肉發生癌變的具體機制仍不清楚，以往較多的研究結果顯示，硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)不僅參與機體氧化應激過程[5]，還通過與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)的作用參與調控糖尿病、腎病、乳腺癌、膀胱癌、動脈粥樣硬化以及白血病等疾病的進程[6-8]。本研究通過觀察Trx與TXNIP在結腸息肉癌變過程中的表達及規律，以探索兩者在結腸息肉癌變中所起的作用，為后續研究腫瘤的診治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北北方學院附屬第一醫院2019年1月～2019年10月消化內科門診和住院患者共100例，其中男68例，女32例，年齡39～62歲，平均(49.34±5.31)歲。其中結腸息肉(結腸息肉組)20例、結腸腺瘤(結腸腺瘤組)40例、結腸癌(結腸癌組)20例以及正常結腸(正常結腸組)20例。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會審核、批準。納入標準：①電子結腸鏡檢查，明確有結直腸息肉且病理診斷明確為結腸息肉、結腸腺瘤和結腸癌。②所有患者術前均未接受過化療、放療及靶向治療。排除標準：①罹患潰瘍性結腸炎、克羅恩病及其他急慢性結腸炎患者。②非腺瘤惡變的結直腸癌患者。③罹患嚴重心腦血管疾病、血液疾病、炎癥性疾病、缺血/再灌注損傷、糖尿病腎病、視網膜病變等，不能承受內鏡下息肉切除者。④依從性差，不能配合完成內鏡下息肉切除者。

1.2 主要材料與試劑 Trx ELISA檢測試劑盒與TXNIP ELISA檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，HE染色試劑盒與免疫組織化學染色試劑盒購自上海碧云天研究所，TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 以及SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購自日本TAKARA公司，胰島素與NADPH購自美國Sigma公司，鼠抗人Trx抗體、鼠抗人TXNIP抗體以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司，其他試劑均為國產分析純，本研究使用的引物序列交由上海生工生物公司合成。

1.3 血清Trx、TXNIP含量與Trx活性測定 患者在空腹情況下通過外周靜脈采血，室溫下靜置30 min，在離心機中以4000 rpm/s離心 10 min，分離收集上清液，保存于-80℃冰箱中。通過ELISA法檢測血清Trx與TXNIP 含量，采用胰島素還原法檢測血清Trx活性，所有步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 HE染色 將采集的組織經4%多聚甲醛固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片機上連續切片為厚度約4 μm的石蠟切片，采用蘇木精染色 5 min，流水沖洗多余染液，再使用伊紅染色液染色3 min，流水沖洗干凈，通過無水乙醇脫水和二甲苯中透明后，利用中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.5 免疫組織化學染色 將制備的石蠟切片脫蠟至水，使用0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液進行抗原修復，加入3% H2O2溶液處理10 min，去除內源性過氧化物酶活性，然后加入10%羊血清工作液在室溫下封閉 30 min，接著滴加鼠抗人Trx(1∶100)、TXNIP(1∶100)作為第一抗體，置于4℃下孵育過夜。第二日，采用PBS 溶液沖洗后，滴加對應的二抗抗體，在室溫下孵育30 min，PBS 溶液再次清洗，滴加DAB 顯色，經過復染后，采用中性樹膠封片，在電子顯微鏡下觀察并進行圖像采集。所有病理染色標本均由2名病理醫師進行判斷，蛋白陽性表達表現為棕黃色至棕褐色。以陽性腫瘤細胞數及染色強度進行綜合評定，染色強度為未著色記 0 分；淺黃色記1分；棕黃色記2分；褐色記3分。陽性細胞比例為0%記為0分；1%～30%記為1分；31%～60%記為2分；>60%記為3分。最后將染色強度及陽性細胞比例相加，小于2分判定為陰性結果，大于等于2分判定為陽性結果。

1.6 實時熒光定量PCR 將各組織在無菌條件下剪碎并研磨勻漿，根據TRIzol法提取組織的總RNA，使用NanoDrop2000 紫外分光光度計檢測提取RNA 的純度、濃度。通過PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA進行反轉錄實驗合成cDNA，接著以cDNA為模板，利用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明進行實時熒光定量PCR實驗來檢測各組織中Trx、TXNIP的mRNA表達水平，以GAPDH作為內參基因。擴增條件為：95℃ 5 min(循環1次)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s(循環40次)，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達水平。通過Primer Premier5軟件設計各基因的引物序列，Trx：上游引物5′-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，下游引物5′-TGTCACGCAGATGGCAACTG-3′； TXNIP：上游引物5′-GACTTCGGAGTACCTGCGC-3′，下游引物5′- AAGCTCAAAGCCGAACTTGTA CTCA-3′；GAPDH：上游引物5′-TGTGAAGGTCGG TGTGAAC-3′，下游引物5′-CAGATGGTGATGGG CTGCC-3′。

2 結果

2.1 各組患者血清Trx、TXNIP 含量與Trx活性比較 各組患者血清Trx、TXNIP 含量與Trx活性檢測結果顯示，與正常結腸組比較，結腸腺瘤組與結腸癌組患者血清中Trx含量和活性均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；而結腸息肉組、結腸腺瘤組與結腸癌組患者血清中的TXNIP 含量較正常結腸組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組患者血清Trx、TXNIP含量與Trx活性比較

2.2 各組患者組織中的HE染色結果 HE染色結果顯示，正常結腸組組織結構清晰完整，未見明顯異常；結腸息肉組組織表現出隱窩結構擴張，組織內可見囊性腫物，伴黏液化，可見明顯的炎性細胞浸潤現象；結腸腺瘤組組織可見明顯的隱窩不規則的擴張，并伴隨著不規則的分支；結腸癌組組織炎性細胞浸潤區域較大，伴有黏膜下層炎癥現象，組織細胞形態受到明顯的破壞。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組組織學特征

2.3 Trx在各組患者組織中的表達檢測 通過免疫組化染色檢測Trx在正常結腸、結腸息肉、結腸腺瘤及結腸癌組織中的表達情況，結果顯示，Trx在結腸腺瘤組和結腸癌組組織中的陽性表達率明顯高于正常結腸組，差異具有統計學意義(P<0.05)；而結腸息肉組中Trx陽性表達率與正常結腸組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表2。

表2 Trx在各組患者組織中的表達

圖2 免疫組織化學染色檢測各組織中Trx表達(200×)

2.4 TXNIP在各組患者組織中的表達檢測 利用免疫組化染色檢測TXNIP在正常結腸、結腸息肉、結腸腺瘤及結腸癌組織中的表達情況，結果顯示，與正常結腸組比較，結腸腺瘤組和結腸癌組組織中TXNIP陽性表達率明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；而結腸息肉組組織中TXNIP陽性表達率與正常結腸組組織差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表3。

表3 TXNIP在各組患者組織中的表達

圖3 免疫組織化學染色檢測各組織中TXNIP表達(200×)

2.5 四組患者組織中Trx、TXNIP的 mRNA表達水平比較 實時熒光定量PCR檢測各組組織中Trx、TXNIP mRNA的表達水平，結果顯示，與正常結腸組比較，結腸息肉組、結腸腺瘤組組織以及結腸癌組組織中Trx mRNA的表達水平均明顯上調，而TXNIP mRNA的表達水平均明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 實時熒光定量PCR檢測各組織中Trx mRNA與TXNIP mRNA的表達

3 討論

目前，雖結直腸癌(CRC)的治療方法取得了很大進步，但CRC死亡率仍位于所有腫瘤死亡率的第五位[1]。CRC通常采用侵入性外科手術方法去除患者的大部分癌癥組織。為了根除殘余的癌組織，在外科手術后經常使用放射療法或化學療法輔以治療[9-10]，雖患者的預后得到了較大改善，但癌細胞終會對化學治療劑產生耐藥性，從而導致這些治療方案的失敗[11]。因此，從分子層面尋找關鍵部位的有效靶點，對于揭示驅動CRC進展的機制以及CRC患者獲得更好治療和改善預后奠定了基礎。

結腸息肉是結腸和直腸上皮上形成的增生組織，屬于消化道中常見的疾病類型，其形成與多種因素相關，主要包括遺傳、環境、飲食以及生活習慣[3]。結腸息肉多無明顯癥狀，常在體檢或結腸鏡檢時偶然發現，部分病例可表現為便血、粘液便腸梗阻、息肉脫垂等癥狀[12]。結腸息肉可分為非腫瘤性息肉(增生性、炎癥性)和腫瘤性息肉(腺瘤性息肉)，非腫瘤性息肉發生癌變的幾率較小，而腺瘤性息肉惡變的幾率較高。據研究[13]顯示，息肉的各種分子變化可導致惡性腫瘤的發生，大約三分之二的結腸息肉是腺瘤性癌前病變。腺瘤根據其組織學特點分為管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、管狀絨毛腺瘤和鋸齒狀腺瘤四種，約80%的結腸癌由結腸腺瘤演變而來，結腸腺瘤演變成為結腸癌歷時5～10年[14]，患者生存率與腫瘤的檢出時間密切相關，5年生存率在早期患者中可高達90%以上，而在晚期患者中僅為5%左右，然而超過約50%的患者確診時已出現癌細胞轉移的現象[15]。關于結直腸腺瘤發生和惡變的病因及確切機制至今仍未完全明確，腺瘤癌變是一個多基因變化與多階段綜合作用累積的復雜過程。

硫氧還蛋白系統是一類具有氧化還原活性的小分子蛋白系統，由還原的底物硫氧還蛋白(Trx)、還原型輔酶(NADPH)和硫氧還蛋白還原酶(TRXR)組成，在TRXR催化下，將還原當量從還原的底物轉移至Trx，Trx通過二硫醇-二硫鍵交換將還原劑分配至選定的靶標，從而導致靶蛋白的結構和功能修飾能夠發揮調節細胞內氧化還原狀態、激活轉錄因子促進細胞生長以及抑制細胞凋亡等功能[5,16]。Trx作為具有氧化還原活性的二硫化物低分子量蛋白質，多項研究結果發現，Trx在腫瘤細胞中的功能隨著腫瘤發展階段的不同而不同，一旦細胞發生惡性變異，Trx表現出促腫瘤細胞生長及抗凋亡的功能，加速腫瘤進展，并與腫瘤血管形成和轉移擴散密切相關[17]。如Zhou 等[18]研究表明了Trx表達在急性髓細胞性白血病患者和急性淋巴細胞性白血病患者中均被上調，此外白血病細胞系THP-1、U937和MOLM-13細胞中c-Jun激活結構域結合蛋白1(Jab1)和Trx蛋白表達水平也均升高。Lu等[19]通過研究表明了在結腸癌細胞中Trx系統通過活化NF-κB途徑從而上調Bcl-2、CyclinD1等促進腫瘤進程相關基因的表達。硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)屬于硫氧還蛋白結合蛋白的家族成員，作為Trx的配體蛋白，能夠負向調節Trx的功能，促進活性氧的產生與積聚，誘導炎癥反應或細胞凋亡的發生[20]。研究表明，血管炎癥性疾病、缺血/再灌注損傷、糖尿病腎病、視網膜病變等疾病的發生與 TXNIP 表達的上調密切相關，而在多種腫瘤疾病中TXNIP 表達明顯降低[21-22]。關于硫氧還蛋白及硫氧還蛋白相互作用蛋白在腫瘤疾病例如肝癌、結直腸癌、胃癌等已有研究，而這兩種腫瘤相關性因子在結直腸腺瘤以及癌變過程中起到的作用未見報道，本研究結果表明，結腸腺瘤患者與結腸癌患者血清中Trx含量與Trx活性明顯升高， TXNIP 含量明顯下降，同時，結腸息肉組織、結腸腺瘤組織以及結腸癌組織中Trx、TXNIP的表達水平也呈不同程度的上調與下調。由此說明，Trx與TXNIP可能參與了結腸息肉的癌變過程。

4 結論

本研究結果顯示，在結腸息肉癌變中Trx異常高表達而TXNIP表達降低，兩者可能都參與了結腸癌變。本結果為結腸息肉癌變的分子機制研究提供了新思路，并為多指標聯合預測結腸癌患者的預后和治療效果提供了科學依據。