SIRT3 HIF-1α FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的表達及意義*

鄭磊 劉立杰 康麗影 程嚴 高立明

(1.秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤一科，河北 秦皇島 066000;2.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，天津 300000;3.秦皇島市第一醫(yī)院消毒供應室，河北 秦皇島 066000)

胃癌是我國發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，由于該疾病在早期缺乏特異性癥狀，早期診斷困難，多數患者就診時已處于中晚期，治療效果不佳[1]。因此，尋求特異性生物學標志物對胃癌患者早期診斷與治療意義重大[2]。當前，已發(fā)現多種物質可作為潛在的胃癌標志物，如糖類抗原、癌胚抗原、miRNAs、成纖維生長因子等[3]。有研究發(fā)現，去乙酰化酶3(SIRT3)和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)參與了腫瘤細胞能量代謝、血管生成，并與肝細胞生長因子(HGF)一樣，可影響腫瘤細胞的轉移、浸潤等過程[4-6]；成纖維細胞活化蛋白(FAP)是癌相關成纖維細胞(TAFs)的特異性標志物，參與了細胞外基質的重塑與血管生成，在腫瘤細胞的的侵襲轉移過程中，也發(fā)揮了重要作用[7]。當前，有關SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在胃癌中表達的研究已有報道，但系統(tǒng)地研究以上指標在不同臨床分期胃癌組織中的表達及其表達相關性的報道較少。為進一步了解SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF表達與胃癌臨床分期的關系及在胃癌組織中表達的相關性，本研究采用疫組化法檢測其在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月～2018年12月秦皇島市第一醫(yī)院收治的胃癌患者83例，其中男48例，女35例，年齡45～78歲，平均(61.74±10.38)歲；分化程度：高分化腺癌13例，中分化腺癌25例，低分化腺癌28例，未分化17例；胃癌TNM分期：T分期(原發(fā)灶)：T1+T2(無血管受侵+有血管受侵或多發(fā)腫瘤直徑≤5cm)16例，T3+T4(多發(fā)腫瘤直徑>5cm+侵及周圍組織)67例；N(區(qū)淋巴結)分期：N0(無淋巴結轉移)28例，N1(區(qū)域淋巴結轉移)55例；M(遠處轉移)分期：M0(無遠處轉移)52例，M1(有遠處轉移)31例。取患者的原發(fā)腫瘤組織和癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)制作3 μm切片標本。取樣后立即放入液氮保存，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。納入標準：①經病理組織學檢查確診為胃癌。②患者均為原發(fā)病灶首次手術切除，術前未接受放化療。③臨床資料完整。排除標準：合并其他嚴重腫瘤疾病。本研究患者知情同意，并經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學法 所有石蠟標本4～5 μm連續(xù)切片，依次二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化，枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L)微博抗原熱修復，羊血清室溫下封閉。加入即用型一抗(鼠抗人HIF-1α單抗、兔抗人SIRT3單抗、HGF兔多克隆抗體、鼠抗人FAP單抗)，4℃低溫過夜，PBS清洗，加入免疫組織化學試劑1、2溫育0.5 h，清洗后DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。由兩位高資歷的病理科專科醫(yī)生進行雙盲式獨立閱片，每例觀察2張切片，于顯微鏡下隨機選擇5個區(qū)域進行觀察。

1.2.2 結果判定 HIF-1α的染色結果判定根據腫瘤細胞的染色比例進行判定，以已知的表達陽性組織切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。以(+)～(+++)為陽性，其中，(-)為陰性，細胞核未染色或染色范圍<1%；(+)為弱陽性，細胞核染色范圍為1%～10%，存在較弱的胞質染色；(++)為中度陽性，細胞核染色范圍為10%～50%，存在明顯的胞質染色；(+++)為強陽性，細胞核染色范圍>50%，胞質染色較強。SIRT3的染色結果判定根據腫瘤細胞棕黃色陽性信號的強弱及染色面積進行判定。以(+)～(+++)為陽性，其中(-)為陰性，陽性率≤5%；(+)為弱陽性，陽性率為6%～25%，胞質中出現黃色顆粒；(++)為中度陽性，陽性率為26%～50%，胞質中出現棕黃色顆粒；(+++)為強陽性，陽性率>50%，胞質中出現棕褐色顆粒。FAP和HGF的染色結果判定根據陽性染色細胞百分比和染色強度進行判定[8]。以(+)～(+++)為陽性，陽性染色細胞百分比計分標準為：<5%記0分，5%～24%記1分，25%～49%記2分，>50%記3分；染色強度計分標準為：無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。二者計分乘積為最終結果。

2 結果

2.1 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在癌組織和癌旁正常組織中陽性表達比較 SIRT3在胃癌組織中的陽性表達主要定位于細胞質中(見圖1A)，其陽性表達率低于在癌旁組織中的陽性表達率(P<0.05)；HIF-1α和HGF在胃癌組織中的陽性表達主要定位于細胞核(見圖1B、圖1C)，二者在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)；FAP在胃癌組織中的表達主要定位于細胞質，陽性表達率為51.81%(見圖1D)，在癌旁組織中不表達(P<0.05)。見表1。

圖1 胃癌組織中SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF的陽性表達(200×)

表1 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在癌組織和癌旁正常組織中陽性表達比較[n×10-2)]

2.2 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的表達比較 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在胃癌組織中的表達與胃癌TNM分期顯著相關(P<0.05)，見表2。

表2 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的陽性表達比較[n(×10-2)]

2.3 胃癌組織中SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF表達之間的相關性分析 相關性分析結果顯示，83例胃癌組織中SIRT3與HIF-1α、FAP、HGF的表達呈負相關(P<0.05)；HIF-1α與FAP、HGF的表達呈正相關(P<0.05)；FAP與HGF的表達呈正相關(r=0.508，P=0.032)，見表3、表4。

表3 SIRT3的表達與HIF-1α、FAP和HGF表達的相關性分析

表4 HIF-1α的表達與FAP、HGF表達的相關性分析

3 討論

SIRT3是一種去乙酰化酶，可參與氧化途徑的激活，調節(jié)細胞內活性氧穩(wěn)態(tài)，與細胞死亡和腫瘤發(fā)生關系密切，被認為是線粒體內的抑癌基因[9]；HIF-1α是決定HIF-1活性的氧調節(jié)亞單位，可參與腫瘤細胞能量代謝、轉移及血管生成等[10]；FAP是腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制物，可抑制機體的免疫效應，參與細胞外基質重塑，進而促進腫瘤的侵襲與轉移[11]；HGF是一種血管形成刺激因子，除刺激新生血管形成外，還參與了腫瘤細胞的分裂、遷移和形態(tài)變化，在多種癌組織中呈高表達狀態(tài)[12]。本研究結果顯示，SIRT3在胃癌組織中的陽性表達主要表達于細胞質中，其陽性表達率低于在癌旁組織中的陽性表達率，與高立明等[13]的研究結果類似。SIRT3可通過錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的歧化反應減少細胞內活性氧，從而增強細胞的抗氧化活性，當SIRT3表達降低時，細胞內活性氧隨之上升，導致脂質和蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)被打破，加速腫瘤細胞的遷移與惡性轉變[14]。這也是SIRT3在胃癌組織中表達水平較低的原因。研究發(fā)現，SIRT3的低表達可介導HIF-1α的穩(wěn)定性[15]。本研究結果顯示，HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，提示HIF-1α會在胃癌組織中過度表達。吳友亮等[16]發(fā)現，HIF-1α mRNA和蛋白在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁正常組織，且胞核定位陽性率高于胞質，認為HIF-1α的不同定位與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關。本研究中HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達也主要位于細胞核，可能與HIF-1α胞質定位無生物學作用，HIF-1α只有進入胞核內才能發(fā)揮調節(jié)血管內皮生長因子表達的作用有關[17]。

對比胃癌組織與癌旁組織中HGF的陽性表達率可知，其在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，與谷光福等[18]的研究結果一致，其發(fā)現HGF在胃癌組織中及癌旁組織中的陽性表達率分別為79.8%和45.7%，認為在腫瘤增殖和侵襲過程中，HGF/肝細胞生長因子受體(c-Met)通路被激活，促進了腫瘤血管生成和化療抵抗，因此HGF低表達者病情進展更慢、總生存期更長。此外，本研究中FAP在胃癌組織中的陽性表達率為51.81%，在癌旁組織中不表達，與湯蘇敏等[19]的研究結果一致。

進一步分析SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF與胃癌臨床分期關系顯示，四者在胃癌組織中的表達與胃癌TNM分期顯著相關，且腫瘤侵襲周圍組織、存在區(qū)域淋巴結轉移和遠處轉移患者，SIRT3表達水平越低，HIF-1α、FAP和HGF表達水平越高，提示四者可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，且SIRT3對胃癌的發(fā)展過程具有一定的抑制作用。分析其原因可能是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中會出現乏氧現象，缺氧條件下HIF-1α可提高參與葡萄糖代謝、血管生成等的重要基因的轉錄水平，進而提高胃癌細胞的侵襲能力，當SIRT3表達水平下降時，HIF-1α活性增加，促進了腫瘤表型的顯現[20]。研究發(fā)現，SIRT3可作用于多種酶參與氧化途徑的激活，低表達水平的SIRT3會導致錳超氧化物歧化酶(MnSOD)表達降低，從而增高細胞內活性氧(ROS)濃度，而高濃度的ROS會影響基因、脂質和蛋白的穩(wěn)定性[21]，可能在一定程度上影響TAFs的表達，進而影響FAP和HGF等細胞因子的生成。

相關性分析結果顯示，83例胃癌組織中SIRT3與HIF-1α、FAP、HGF的表達呈負相關，HIF-1α與FAP、HGF的表達呈正相關，FAP與HGF的表達呈正相關，提示四者在胃癌組織中的表達均存在相關性。逯頂松等[22]采用RNA干擾技術，使SIRT3基因表達下調或缺失，觀察其下調或缺失后對HIF-1α表達的影響發(fā)現，SIRT3-小干擾RNA轉染后，SIRT3蛋白表達明顯下降，HIF-1α表達明顯升高，HIF-1α的表達受SIRT3調控，且二者表達呈負相關。由于目前未見HIF-1α、FAP和HGF表達水平的相關性研究，有關三者在胃癌組織中的表達均存在相關性這一結論有待后續(xù)擴大樣本量進行驗證。

4 結論

SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF的表達水平與胃癌的TNM分期存在相關性，它們可能共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，SIRT3的表達可能起到負向調控HIF-1α、FAP和HGF的作用。