LncRNA UCA1通過調節miR-206/PTP1B軸影響宮頸癌細胞增殖 遷移及侵襲*

馮艷 孫延霞 賀晶 李紅霞

(延安大學附屬醫院婦科，陜西 延安 716000)

宮頸癌是全世界女性第四位常見癌癥，雖然宮頸篩查降低了宮頸癌的發病率和死亡率，但據統計，2018年全球宮頸癌新增病例約為569847例，死亡人數為311365人[1]。90%以上的宮頸癌死亡病例發生在發展中國家。發達國家中美國和東南亞地區2018年仍有13240和62356例新增宮頸癌病例[1-2]。宮頸癌疾病形勢依然嚴峻，因此，闡明宮頸癌發病機制對宮頸癌的治療具有十分重要的意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是長度大于200個堿基的長鏈非編碼序列[3]，其通過染色質修飾、轉錄調控和轉錄后調控參與調控基因表達，在多種癌癥的發生和疾病的發生發展過程中發揮著關鍵作用[4]。據報道，lncRNAs的異常表達與宮頸癌預后相關[5]。LncRNA尿路上皮癌胚抗原1(LncRNA urothelialcarcinomaassociated1，LncRNA UCA1) 可作為內源競爭RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)調控基因表達[6]。除此以外，還作為致癌基因，與人類癌癥的發生、發展密切相關[7]。miRNA通過調控腫瘤細胞增殖、轉移、耐藥、凋亡、血管生成和代謝，參與腫瘤的生長和進展[8]。研究表明，LncRNA UCA1通過miR-206 / CLOCK軸促進神經膠質瘤細胞生長和侵襲[9]。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)是一種參與生長因子信號傳導的非受體型致癌啟動子[10]。證據顯示，miR-206通過下調蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究探討LncRNA UCA1通過miR-206/PTP1B軸對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌致病機制的探究和治療提供新的科學依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 人原代正常宮頸上皮細胞(NCEC)購自美國典型培養物保藏中心；宮頸癌細胞系Siha、CaSki、Hela、ME180、C33A和HEK-293T細胞系購自中國科學院細胞庫(上海)；si-LncRNA UCA1(si- UCA1)、si-PTP1B、LncRNA陰性對照(si-NC)、miRNA陰性對照(miR-NC)、miR-206 mimic(miR-206)、miR-206 inhibitor(anti-miR-206)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；CCK-8購自日本同仁化學研究所；PTP1B和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TAKARA公司；ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司；酶標儀購自美國賽默飛公司；蛋白電泳儀購自美國伯樂。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染、分組 本實驗在延安大學生命科學學院進行，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180、C33A和HEK-293T細胞均用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。待C33A細胞(或HEK-293T細胞)密度達到80%～90%時，0.25%胰酶消化細胞，隨后細胞按4×105個/孔密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養箱中培養12h后，將細胞隨機分為對照組、si-NC組(轉染si-NC)、si-UCA1組(轉染si-UCA1)、si-PTP1B組(轉染si-PTP1B)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-206組(轉染miR-206)、anti-miR-206組(轉染anti-miR-206)、miR-NC+si-NC組(轉染miR-NC 和si-NC)、miR-206+si-NC組(轉染miR-206和si-NC)、anti-miR-206+si-NC組(轉染anti-miR-206和si-NC)、anti-miR-206+si-UCA1組(轉染anti-miR-206和si-UCA1)、miR-NC+si-PTP1B組(轉染miR-NC和si-PTP1B)、anti-miR-206+si-PTP1B組(轉染anti-miR-206和si-PTP1B)，按照Lipofectamine2000說明書進行si-UCA1、si-PTP1B、si-NC、miR-NC、miR-206和anti-miR-206的轉染，終濃度均為50nM，對照組不進行轉染操作。37℃，5%CO2條件下培養48h后，進行后續實驗。

1.2.2 CCK-8 C33A細胞經0.25%胰酶消化后， DMEM培養基重懸細胞，向96孔板中加入100μL細胞懸液(5×103個/孔)。37℃、5%CO2條件下繼續培養48h后，每孔加入10μL CCK-8，37℃、5%CO2條件下孵育3h。酶標儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.2.3 普通PCR 收集NCEC 、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA。根據2×PCR Master Mix說明書所示，配制反應體系，反應條件為：94℃、3 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、40 s，35個循環；72℃、5 min。反應結束后，取5 μL反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物序列表，見表1。

1.2.4 qRT-PCR 收集轉染后的C33A細胞，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉錄合成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR。反應條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個循環；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。miR-206以U6為內參，UCA1以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-206和UCA1的表達。所需引物序列,見表1。

表1 qRT-PCR所需引物序列

1.2.5 Western blot 收集轉染后的C33A細胞，RIPA裂解液裂解細胞，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE分離，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3h，PTP1B抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)4℃過夜孵育，PBST清洗后，HRP標記二抗(1∶2000)室溫孵育1h。 ECL化學發光法檢測蛋白條帶并拍照。

1.2.6 流式細胞術 收集轉染后的C33A細胞，PBS清洗細胞后，Binding Buffer重懸細胞，隨后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育15min，加入PI室溫避光孵育5min，1h內用流式細胞儀檢測。

1.2.7 Transwell 遷移實驗：上腔室加入100μL C33A細胞懸液(5×104個細胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養基，37℃、 5%CO2條件下培養24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。侵襲實驗：Matrigel用無血清DMEM培養基稀釋(稀釋比例1∶5)。取100μL稀釋液加入各上腔室中，37℃孵育至凝固。隨后上腔室加入100μL C33A細胞懸液(5×104個細胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養基，37℃、 5%CO2條件下培養24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。

1.2.8 熒光素酶報告實驗 針對UCA1 3′-UTR端和PTP1B 3′-UTR端序列構建野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質粒。參照1.2.1步驟，將UCA1-WT和UCA1-MUT(或PTP1B-WT和PTP1B-MUT)分別與miR-NC、miR-206共同轉染至HEK-293T細胞中，48h后檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 下調UCA1抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡 普通PCR檢測發現，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞UCA1基因擴增片段均為單一條帶，大小與預期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗；對照組、si-NC組和si-UCA1組UCA1基因擴增片段均為單一條帶，大小與預期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗(見圖1A、圖1B)。qRT-PCR、CCK-8和流式細胞術實驗結果顯示，與NCEC相比，Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞UCA1表達均顯著升高(P<0.01)(見圖1A)，其中C33A差異最明顯，因此選擇C33A細胞系進行后續實驗；與si-NC組相比，si-UCA1組細胞UCA1表達和細胞活力顯著降低(P<0.01)(見圖1B、圖1C)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖1D。

圖1 下調UCA1抑制宮頸癌細胞增殖并促進凋亡

2.2 下調UCA1抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-UCA1組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 下調UCA1抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲

2.3 miR-206與UCA1的相互調控作用 普通PCR檢測發現，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗；si-NC組和si-UCA1組UCA1和miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗。qRT-PCR、熒光素酶報告實驗結果顯示，與NCEC相比，Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞miR-206表達均顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-UCA1組細胞UCA1表達顯著降低(P<0.01)，miR-206表達顯著升高(P<0.01)；miR-206與UCA1的結合位點(見圖3E)；與miR-NC組相比，miR-206可顯著降低UCA1-WT熒光素酶活性(P<0.01)，而對UCA1-MUT熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。見圖3。

圖3 miR-206與UCA1的相互調控作用

2.4 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞增殖并抑制細胞凋亡 普通PCR檢測發現，miR-NC組、miR-206組和anti-miR-206組miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗。qRT-PCR、CCK-8和流式細胞術實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-206組細胞miR-206表達顯著升高(P<0.01)，anti-miR-206組則顯著降低(P<0.05)；與miR-NC+si-NC組相比，miR-206+si-NC組細胞活力顯著降低(P<0.05))，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，anti-miR-206+si-NC組細胞活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-UCA1組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。見圖4。

圖4 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞增殖并抑制細胞凋亡

2.5 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結果顯示，與miR-NC+si-NC組相比，miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，anti-miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著升高(P<0.01)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si- UCA1組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)，見圖5。

圖5 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞遷移和侵襲

2.6 miR-206靶向調控PTP1B miR-206與PTP1B的結合位點(見圖6A)。由qRT-PCR和Western blot實驗結果可知，與miR-NC組相比，miR-206組細胞PTP1B-WT熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而PTP1B-MUT熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)；與miR-NC組相比，miR-206組細胞PTP1B蛋白表達顯著降低(P<0.01)，anti-miR-206組PTP1B蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見圖6。

圖6 miR-206靶向調控PTP1B

2.7 miR-206靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡 Western blot、CCK-8和流式細胞術實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-PTP1B組細胞PTP1B蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與miR-NC+si-NC組相比，anti-miR-206+si-NC組細胞活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，miR-NC+si-PTP1B組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-PTP1B組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-206靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡

2.8 miR-206通過靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結果顯示，與miR-NC+si-NC組相比，anti-miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著升高(P<0.05)， miR-NC+si-PTP1B組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-PTP1B組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，見圖8。

圖8 miR-206通過靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲

3 討論

宮頸癌是影響女性人群的最常見的惡性腫瘤之一，給女性的健康帶來了嚴重的威脅[12]。在過去的三十年中，宮頸癌的發病率和死亡率已大大降低。 然而，宮頸癌仍然是全世界女性中第四位最常見的惡性腫瘤，因此，探究宮頸癌致病機制及尋找新的治療靶點是宮頸癌治療的當務之急。

近年來，越來越多的證據表明lncRNAs在宮頸癌的發生和發展中起著重要的調節作用[13]。目前，有證據表明lncRNAs在癌細胞多種進程中起著關鍵作用，如細胞增殖、上皮-間充質轉化(EMT)和轉移等[14]。研究表明，lncRNA MEG3通過miR-23 a/APAF1軸抑制喉癌細胞增殖并促進凋亡[15]。lncRNA UCA1通過海綿化抗腫瘤的miRNA促進胃癌的增殖、遷移、免疫逃逸并抑制細胞凋亡[16]。UCA1是一種重要的致癌lncRNA，是人內源性逆轉錄病毒H家族成員之一[17]。研究表明， UCA1在胚胎組織中廣泛表達，而在大多數正常成人組織(除了心臟和脾臟)中不表達[18]。UCA1在多種癌癥中異常上調并發揮致癌作用[19-20]。本研究結果顯示，宮頸癌細胞中UCA1的表達上調，而敲低 UCA1可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，該研究結果表明，UCA1在宮頸癌細胞中發揮著促腫瘤的作用。越來越多證據表明，lncRNA通過海綿化miRNA參與腫瘤的發生發展過程[15-16]。miR-206是miRNA家族成員之一。已有研究證明，miR-206作為腫瘤抑制因子調控不同腫瘤細胞的生物學特性[21-22]。UCA1通過抑制miR-206表達促進神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲[10]。本研究結果顯示，miR-206在宮頸癌細胞中表達下調，過表達miR-206可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，而敲低miR-206則促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并抑制凋亡。進一步實驗結果顯示，敲低 UCA1可逆轉anti-miR-206對宮頸癌細胞的作用。該研究結果表明，UCA1通過抑制miR-206表達促進宮頸癌細胞的生物學進展，在宮頸癌中發揮著促腫瘤的作用。

PTP1B是一種典型性非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在代謝信號傳導中起關鍵作用，在不同癌癥中發揮抑癌或促癌作用[23]。研究表明，PTP1B以JNK依賴性機制促進卵巢癌細胞的惡性進展[24]，miR-338-3p通過靶向PTP1B在胃癌中發揮抑癌作用[25]。PTP1B在胰腺腫瘤中高表達，并且與腫瘤轉移和分期呈正相關。下調PTP1B會顯著抑制胰腺癌細胞的生長、遷移和集落形成，抑制胰腺癌的進展[26]。miR-206通過下調PTP1B，抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究結果顯示，敲低PTP1B后，可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，miR-206靶向調控PTP1B，敲低PTP1B可明顯逆轉anti-miR-206對宮頸癌細胞的作用。該研究結果表明，PTP1B在宮頸癌中發揮著促腫瘤的作用，miR-206通過靶向PTP1B，抑制宮頸癌細胞的生物學進展。

4 結論

本研究結果提示，LncRNA UCA1通過調節miR-206 / PTP1B軸促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果為進一步闡釋宮頸癌細胞的發病機制及開發新的治療方法提供了理論依據。