環狀RNA MYLK對子宮內膜癌細胞生長 凋亡和侵襲及上皮間質轉換的影響*

倪換娟 周維 李廣瑩 曲長紅 裴麗鵬

(北部戰區總醫院和平院區,遼寧 沈陽 110000)

子宮內膜癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，其快速增長的發病率引起人們的高度關注[1]。其在絕經前后婦女中是發病率最高的癌癥[2]。腫瘤細胞的研究日益受到重視，對子宮內膜癌細胞的研究可以深入了解子宮內膜癌的發生機制，為臨床治療提供新的方向。

環狀RNA是一類新的內源性非編碼RNA，其特點是其共價閉環結構沒有5′帽或3′ poly A尾[3]。雖然環狀RNA產生和功能的機制尚不完全清楚，但最近的研究表明，環狀RNA可能作為疾病診斷和治療的潛在分子標志物，在人類疾病的發生和進展中發揮重要作用，尤其是在腫瘤中[4]。近年來，關于環狀RNA在子宮內膜癌中的研究有少量報道。Shen等結果顯示，circ_0002577通過調控miR-197/CTNND1[5]軸及激活Wnt/β-catenin通路促進子宮內膜癌進展。Liu等[6]報告稱，circ_0061140通過調節miR-149-5p/STAT3促進子宮內膜癌進展。Zong等[7]的研究指出，circ_PUM1通過靶向miR-136/NOTCH2通路促進子宮內膜癌的發生[7]。還有研究表明，circTNFRSF21通過調控miR-1227-MAPK13/ATF2軸促進子宮內膜癌的發病機制[8]。然而，環狀RNA MYLK對子宮內膜癌的作用還未見報道。本研究探討子宮內膜癌HEC-1A細胞生長、凋亡、侵襲及上皮間質轉化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 HEC-1A細胞(人子宮內膜腺癌細胞)購自武漢Procell公司；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；Dulbecco改良的Eagle培養基、SYBR Green Master Mix購自美國Thermo Fisher公司；GV248 干擾載體購自中國吉凱基因公司；Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-逆轉錄酶購自美國Invitrogen公司；RNA purification system購自德國Qiagen公司；DNase-I購自瑞士Roche公司；隨機六聚體購自美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶、Giemsa染色液、10 mg/mL RnaseA、碘化丙啶、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、羊抗兔IgG-HRP、1%結晶紫、ECL化學發光檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗體E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、Ki67，SignalStain?Boost IHC檢測試劑、SignalStain DAB Substrate Kit購自美國CST公司。ABI Prism 7000系統購自美國Applied Biosystems公司； C6流式細胞儀購自美國BD公司；E100光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 實驗動物 選取20只7周齡清潔級雄性BALB/c裸小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)。實驗動物生產許可證號 ：SCXK(京)2018-0002。飼養溫度18～25℃，濕度50%～70%。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 HEC-1A細胞保存于含10%胎牛血清(FBS)，37℃，含5% CO2的濕化培養箱中，Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中。

1.3.2 MYLK干擾實驗 選擇三種shRNA：shRNA1、shRNA2、shRNA3用來干擾circMYLK基因。分為對照組、shRNA-NC組、circMYLK- shRNA1組、circMYLK-shRNA2組和circMYLK-shRNA3組。circMYLK-shRNAs是針對circMYLK基因設計的(NC_000003.12)；采用RT-PCR檢測干擾效率。將特異性shRNAs克隆到GV248 干擾載體中。綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體作為陰性對照。慢病毒通過Lipofectamine?2000(將慢病毒質粒轉染HEC-1A細胞。轉染48h后，收集并濃縮含有慢病毒的細胞上清液，校準病毒效價。慢病毒的最終濃度為4×108TU/mL，儲存于-80℃。

1.3.3 異種移植瘤裸鼠模型 小鼠適應性飼養7天。將轉染shRNA-NC和MYLK-shRNA1的HEC-1A細胞皮下注射至右大腿形成異種移植瘤。將小鼠分為shRNA-NC組和MYLK-shRNA1組，每組各10只。分別于第5、10、15、20、25、30天測定腫瘤體積。注射后30天測定腫瘤重量。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(體重200 mg/kg)安樂死。為后續實驗收集腫瘤。所有實驗都是根據動物實驗3R原則制定的，并且得到了醫院倫理委員會的批準。

1.3.4 RT-qPCR法 總RNA用RNA purification system提取。用DNase-I去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉錄酶和隨機六聚體從5 mg總RNA中制備cDNA。對于qRT-PCR，在ABI Prism 7000系統中，使用SYBR Green Master Mix和引物在優化濃度下測定基因表達。檢測基因的引物如下：MYLK正向引物 5′- CAGTGCATGCTGTTTGTTCA-3′，反向引物 5′-TCGGAGCCTTGACTTCCAG-3′；內參基因GAPDH正向引物5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′ ，反向引物5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。所有結果均以GAPDH為基準進行歸一化。

1.3.5 克隆形成實驗 將對照組、shRNA-NC組及MYLK-shRNA1組的HEC-1A細胞接種于6孔板中，每孔200個細胞，連續接種7天。廢棄培養基，每個孔用PBS仔細洗兩次。將菌落在甲醇中固定20min，然后用Giemsa染色液染色。統計≥50個細胞的菌落數，計算菌落形成效率：菌落百分比=菌落形成數/接種細胞數×100%。

1.3.6 流式細胞術 用胰蛋白酶消化HEC-1A細胞，用70%乙醇在4°C下過夜固定細胞。然后加入10 mg/mL RnaseA和碘化丙啶于4℃染色過夜。使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒按照說明書使用流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)檢測細胞凋亡率。AnnexinV-FITC(-)/PI(-)(左下)為正常細胞，AnnexinV-FITC (+)/PI(-)細胞(右下)為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(+)(右上)為晚期凋亡細胞。AnnexinV(-)/PI(+)(左上)為壞死細胞。所有實驗重復三次。

1.3.7 Transwell實驗 HEC-1A細胞經胰蛋白酶處理后，接種于含10%胎牛血清的培養基中，細胞數為3×104個/孔。培養24小時后，用棉簽將上層殘留的細胞取出。遷移后的細胞在室溫下用95%乙醇固定，然后用1%結晶紫染色。在光學顯微鏡下觀察每個孔的五個隨機區域的染色情況。

1.3.8 Western Blot法 用10% SDS-PAGE分離細胞和腫瘤中的蛋白，并轉移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質與第一抗體在4℃下孵育過夜。主要抗體如下：E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP(索萊寶)孵育1h。用ECL化學發光檢測試劑盒觀察這些條帶。

1.3.9 免疫組化法 脫蠟、復水、修復后，用5%正常山羊血清封閉石蠟切片1h，與抗體共培養過夜：Ki67和Vimentin。切片用TBST沖洗，與SignalStain?Boost IHC檢測試劑室溫下孵育30分鐘。切片用SignalStain DAB Substrate Kit染色，在E100光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 shRNAs抑制circMYLK表達的干擾效率檢測 設計circMYLK-shRNA1、circMYLK-shRNA2和circMYLK-shRNA3分別轉染子宮內膜癌HEC-1A細胞，RT-qPCR檢測干擾效率。與對照組(0.99±0.06)比較，circMYLK-shRNA1組 (0.08±0.05)、circMYLK-shRNA2組 (0.48±0.08)和circMYLK-shRNA3 組(0.30±0.07)的MYLK表達均顯著下調(P<0.05)，其中circMYLK-shRNA1組干擾效果最佳，因此選用shRNA1進行后續實驗，見圖1。

圖1 shRNAs抑制circMYLK表達的干擾效率檢測(n=3)

2.2 MYLK干擾對HEC-1A細胞克隆形成的影響 與對照組(48.8±11.2)比較，circMYLK-shRNA1組(11.46±5.89)的克隆形成率顯著降低(P<0.05)。可見，干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的克隆形成，見圖2。

圖2 MYLK干擾對HEC-1A細胞克隆形成的影響

2.3 MYLK干擾對HEC-1A細胞凋亡的影響 與對照組(5.16±2.92)比較，circMYLK-shRNA1組(29.44±6.22)的細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。可見，干擾MYLK能促進HEC-1A細胞的凋亡，見圖3。

圖3 MYLK干擾對HEC-1A細胞凋亡的影響

2.4 MYLK干擾對HEC-1A細胞侵襲的影響 與對照組(48.25±6.67)比較，circMYLK-shRNA1組(18.88±8.11)的侵襲細胞數量顯著減少(P<0.05)。可見，干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的侵襲，見圖4。

圖4 MYLK干擾對HEC-1A細胞侵襲的影響

2.5 MYLK干擾對HEC-1A細胞上皮-間質轉化(EMT)的影響 與對照組比較，circMYLK-shRNA1組的E-cadherin (0.028±0.013 vs 0.134±0.048)表達顯著上調(P<0.05)，而N-cadherin (0.824±0.078 vs 0.040±0.018)和Vimentin (0.544±0.07 vs 0.063±0.037)表達顯著下調(P<0.05)。表明干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的EMT，見圖5。

圖5 MYLK干擾對HEC-1A細胞上皮間質轉化的影響

2.6 MYLK干擾對裸鼠模型移植瘤的影響 轉染shRNA-NC或circMYLK-shRNA1的HEC-1A細胞皮下注射裸鼠建立移植瘤裸鼠模型。注射30d后，與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組的腫瘤體積和腫瘤重量(0.40±0.08 vs 0.15±0.07)均顯著降低(P<0.05)(見圖6A、B、C)。與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組的MYLK表達顯著下調(P<0.05)(見圖6D)。與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組增殖相關的Ki67 (58.42±8.93 vs 14.79±7.17)和侵襲相關的Vimentin (65.91±9.88 vs 18.69±5.98)表達顯著下調(P<0.05)(見圖6E、F)。可見，干擾MYLK能抑制裸鼠移植瘤的生長和EMT。

圖6 MYLK干擾對裸鼠模型移植瘤的影響

3 討論

子宮內膜癌是女性常見的生殖系統癌癥[2]。轉移前腹腔鏡與開腹手術治可能是比較有效的診斷和治療手段[9]，且腹腔鏡子宮內膜癌根治術可能是較優的選擇[10]。然而轉移一旦方發生，治療難度將大大增加。因此，探索轉移的機制，以便開發更多抑制腫瘤增殖和轉移的藥物，對于子宮內膜癌治療很重要。

非編碼RNA已被廣泛證明參與生理、病理和疾病治療過程[11]。如在子宮內膜癌中，長鏈非編碼RNA-C00473高表達于腫瘤組織，可能通過cyclin D1途徑促進子宮內膜癌細胞增殖能力[12]。環狀RNA是閉合環狀的長鏈非編碼RNA，主要由蛋白質編碼基因的外顯子產生。由于不含5′或3′端，在許多情況下，比線性產物更為豐富。某些環狀RNA非分裂細胞中非常豐富，許多也表現出生理特異性和組織特異性的表達[13]。大量重要的研究文章指出了癌癥和某些環狀RNA之間的關系。MYLK是最近表征的促癌基因。MYLK可能是VEGF的重要調控基因。在膀胱癌中，MYLK可能作為miR-29a的內源競爭RNA，激活VEGFA信號促進腫瘤進展[14]。為了考察MYLK在子宮內膜癌中的作用，在本研究中干擾MYLK表達。與此前研究一致，我們發現，MYLK在子宮內膜癌中也扮演著促癌基因的角色。

腫瘤的惡性程度與相關蛋白的表達關系密切，其中Ki67是與細胞分裂有關的蛋白抗原，Ki67的表達量與細胞增殖能力呈正比[15]。而細胞凋亡(Apoptosis)在胚胎發育、系統功能完善、機體內環境穩定等方面起重要作用。當細胞凋亡功能受到抑制時，將導致腫瘤的發生及免疫功能的異常[16]。此外，上皮間充質轉化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤進展、轉移和耐藥性中同樣扮演重要角色[17]。在EMT過程中上皮細胞改變其形態、細胞結構而失去上皮細胞特征，并獲得侵襲性和遷移性間充質表型，參與腫瘤的發生與發展，尤其在促進腫瘤轉移侵襲中發揮著重要作用[18]。其中E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin, N-cad)等是EMT的重要標志物[19]。此外，經歷EMT的細胞表現出與腫瘤干細胞(CSCs)相似的特征，如藥物外排泵的增加和抗凋亡作用[20]。

MYLK可能是通過對腫瘤增殖、侵襲和轉移的調控實現促癌作用的。位于3q21上的MYLK基因通過三個獨立的啟動子編碼三種蛋白質(非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶即nmMLCK，平滑肌MLCK和telokin。nmMLCK調節肌動蛋白的細胞骨架重排和收縮，驅動肌動蛋白單體組裝成聚合物或應力纖維，并進一步發出信號表明肌動蛋白應力纖維收縮[21]。這一過程對于癌細胞增殖和遷移的細胞骨架的快速動態協調至關重要[22]。VEGF信號通路的激活在mRNA和蛋白水平上增加了MYLK基因產物，而MYLK則通過注入調控miR-513a-5p之類的VEGF抑制MiRNA，促進VEGF的高表達[23]。因此，VEGF與MYLK可能構成了一個促進腫瘤增殖遷移的正反饋調節環路。在膀胱癌中上調MYLK可促進上皮間質轉化(EMT)，而敲減MLYK則會抑制細胞增殖、活力并誘導細胞凋亡[14]。有結果顯示，MLYK促進前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉移，干擾MYLK明顯加速了細胞凋亡[24]。Lin等[25]指出，MYLK敲減明顯抑制了肝癌細胞的創面愈合能力和遷移入侵的能力，進而阻礙了肝癌細胞的EMT。Zhao等[26]研究揭示，沉默MYLK后卵巢癌細胞增殖能力明顯減弱。在本研究中，我們的結果表明，干擾MYLK促進了子宮內膜癌HEC-1A細胞凋亡，并抑制了細胞的增殖、侵襲及EMT，進而阻礙體內腫瘤的生長。

4 結論

本研究結果提示，MYLK可促進子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、侵襲及EMT，并阻礙凋亡，MYLK沉默逆轉了上述腫瘤惡性生物學行為，并且抑制了裸鼠模型異種移植瘤的生長。