5-Aza-dC對牛成肌細胞MyoD1啟動子甲基化及mRNA表達的影響

李 雄，田念念，宋林錦，陳 晨，許厚強*

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

表觀遺傳調控多發生在相互作用水平上，在該水平上的研究可深入了解表觀遺傳學對生物學過程的促進作用。大量研究表明，表觀遺傳學是指基因的核苷酸序列不發生改變，而基因功能發生穩定的、可遺傳的變化，主要包括非編碼RNA調控[1]、DNA甲基化[2]、染色質重塑[3]、組蛋白修飾[4]等。DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化轉移酶的作用下，活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)將甲基催化轉移到基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結合一個甲基基團，導致染色體結構、DNA構象、DNA穩定性等發生變化，從而控制基因表達[5]。對DNA甲基化研究主要集中于主動甲基化和去甲基化方面，DNA高甲基化能夠減弱或者沉默基因的表達，而去甲基化時則能使基因活化或重新表達[6]。5-Aza-dC是目前用得較多的去甲基化方法之一，其對研究DNA甲基化對表觀遺傳的影響及特異性基因的表達和調控機理有著重要的作用。5-Aza-dC是一種胞唾陡類似物，常用名為地西他濱甲基化酶抑制劑，是目前已知的較為有效的一種去甲基化制劑[7]。5-Aza-dC大多應用于醫學方面，如Greville等[8]發現，5-Aza-dC處理后，從化療敏感/非轉移細胞系中分泌的n-聚糖的分支和唾液化增加。這些變化與卵巢癌細胞系中MGAT5和ST3GAL4轉錄本mRNA表達水平升高有關。Xie等[9]研究發現，5-Aza-dC能有效抑制DNMTs的表達和活性，逆轉MnSOD和GSTT1的表達。所以，通過藥物、試劑等對相關基因去甲基化探究其表達影響，也是從側面研究甲基化機制的一種方法。

近年來，大量研究表明，DNA甲基化所引起的表觀遺傳對于動物的生長發育有重要影響，并篩選與生長相關的甲基化位點作為分子標記[10]。肌肉組織是動物機體的重要組成部分，而DNA甲基化也能調控肌肉的發育過程[11]。Li等[12]研究了3個品種豬不同部位骨骼肌，發現品種間、性別間存在DNA甲基化的相似性和特異性，并鑒定了差異甲基化區域。李秀金等[13]通過對五指山和長白豬DNA甲基化和轉錄組數據的聯合分析證實，DNA去甲基化酶Tet1在豬胚胎成肌細胞和C2C12細胞中通過Myogenin啟動子去甲基化，上調Myogenin表達，從而促進成肌細胞的分化。萬火福等[14]用比色法測定不同品種肌肉組織DNA甲基化水平，發現DNA甲基化水平在不同品種及不同組織中會呈現一種動態變化，且高水平的DNA甲基化可能促進霞煙雞腿肌組織的發育。綜上表明，不同畜禽肌肉發育過程中的甲基化模式具有一定特異性，不同家畜中甲基化狀態會產生特定變化，這種甲基化狀態變化能夠通過調控不同階段相關基因的表達，從而保證肌肉發育正常進行。

動物肌肉發育是一個極其復雜的過程，動物體內相關基因的甲基化狀態也呈現出動態變化趨勢[15]。肌分化因子(myogenic differentiation 1，MyoD1)是一種骨骼肌特異性轉錄因子，能夠識別、啟動骨骼肌特異基因的轉錄，具有誘導成纖維細胞和其他非骨骼肌細胞分化為骨骼肌細胞的能力[16]。近年來，MyoD1甲基化在豬[17]、羊[18]、雞[19]等家畜上主要通過對肌肉進行全基因組甲基化檢測其甲基化水平；沈蘭等[20]發現，MyoD1的甲基化譜可能有助于預測接受標準化學放射治療的浸潤性宮頸癌患者的反應。目前，MyoD1甲基化對牛骨骼肌細胞發育影響的研究報道較少。本試驗以關嶺牛為研究對象，利用甲基化酶抑制劑(5-Aza-dC)處理牛成肌細胞，研究MyoD1啟動子區甲基化水平及其對成肌細胞生長發育和增殖的影響，為關嶺牛的改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛成肌細胞來源于貴州大學動物科學學院動物種質資源庫。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清、TRIzol 試劑購于Gibco公司；5-Aza-dC(5-氮雜-2′-脫氧胞苷)、細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期試劑盒均購自美國Sigma公司；2×Es Taq Master Mix、DM 2000 Marker、丙三醇、無水乙醇、DEPC 水購自康為世紀生物科技有限公司；SYBR-Green染料(SYBR Green PCR Master Mix)購自Bio-Rad公司；二甲基亞砜購于Hyclone 公司；逆轉錄試劑盒和CCK8試劑盒購自MCE公司；一抗(Desmin)購自鼎國生物技術有限責任公司；二抗購自Jackson immuno research。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞復蘇及鑒定 取出凍存的細胞，復蘇后轉入含15%胎牛血清的DMEM完全培養基中。置于CO2培養箱(培養條件5% CO2、飽和濕度、37 ℃)中繼續培養，讓其長到對數生長期。將培養的細胞接種于6孔細胞培養板上，待其生長至85%左右，進行細胞鑒定；試驗參考間接免疫熒光(indirect immunofluorescence，IIF)的方法執行。

1.3.2 CCK8檢測不同濃度5-Aza-dC對成肌細胞增殖凋亡的影響 細胞復蘇后，當細胞長到85%以上進行分瓶，當關嶺牛成肌細胞處于對數生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化約4 min，并進行計數，以每孔5×103個接種于96孔板內(每孔加入100 μL)。置于CO2培養箱內培養12 h；12 h后加入添加了不同濃度5-Aza-dC的培養基，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3 μmol·L-1以及空白組(0 μmol·L-1)，每組設3個 重復，分別處理0、24和48 h。在每個孔內加入10 μL CKK-8試劑，酶標儀(450 nm)檢測吸光密度(OD)；確定在本實驗室條件下對細胞生長影響最小的5-Aza-dC最適濃度，并以此濃度進行后續試驗。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將對數生長期細胞接種于6孔板內，標記處理組和空白組置于CO2培養箱內培養12 h，用含有5-Aza-dC的DMEM/F12(“1.3.2”獲得5-Aza-dC最適濃度)培養基換液，培養48 h，用3 mL PBS溶液輕輕潤洗培養板內細胞；加入1 mL 0.25%不含EDTA 的胰酶消化；將細胞輕輕重懸于所保留的培養基中，密度大約為1×106個·mL-1，1 000 r·min-1離心6 min，棄去上清液，PBS洗滌2次，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4 ℃，3 h；離心棄去固定液，3.5 mL PBS重懸5 min；將細胞懸液轉移到干凈的離心管內，加入2 μL PI，5 μL Annexin V-FITC，室溫避光反應15 min；室溫1 000 r·min-1離心5 min，去除上清；將細胞用0.5 mL Propidium Iodide預冷緩沖液，用流式細胞儀檢測分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

5-Aza-dC處理細胞48 h后，用預冷PBS洗2次，加入1 mL 0.25%不含EDTA的胰酶消化，1 300 r·min-1離心6 min，獲取細胞沉淀，棄上清，重懸細胞，迅速打入3.5 mL 70%預冷的乙醇中，吹打均勻，4 ℃儲存過夜；離心乙醇固定過的細胞，棄上清；洗滌細胞3次以去除殘留的乙醇；加入100 μL RNase A重懸細胞，37 ℃水浴30 min，加入500 μL PI染色液，4 ℃避光反應30 min；應用流式細胞儀檢測。

1.6 qRT-PCR檢測MyoD1、DNMT1及相關基因mRNA表達

1.6.1 RNA提取及第一條cDNA的合成 5-Aza-dC處理細胞48 h后，處理組和空白組的細胞用Trizol提取總RNA。將RNA定量至2 ng，根據逆轉錄試劑盒進行反應合成cDNA，反應產物置于-20 ℃保存備用。

1.6.2 引物的設計與合成 根據NCBI公布的牛MyoD1(NM_001040478.2)、DNMT1(NM_182651.2)、Caspase-9(NM_001205504.2)、Bax(NM_173894.1)、Bcl(CX950904.1)、CyclinA2(NM_001075123.1)、CyclinB1(BC116011.1)、CyclinD(XM_024991034.1)以及內參基因GAPDH(NM_001034034.2)。利用Primer Premier 5.0軟件進行定量引物設計，最后由重慶擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6.3 qRT-PCR 檢測MyoD1、DNMT1及相關基因表達 以處理組和空白組cDNA為模板分別擴增MyoD1以及相關基因，采用SYBR Green 熒光染料法在實時熒光定量PCR儀上進行定量反應。根據伯樂公司Bio-rad iTaq Univer SYBR(1725121)熒光定量qPCR mix試劑盒制作上機 PCR 混池，混池體系為10 μL：ULtraSYBR Mixture(High ROX)5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板0.7 μL，ddH2O 2.3 μL。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s；58 ℃ 30 s，40 個循環后，進行熔解曲線分析；以每5 s 上升0.5 ℃的速率從65 ℃升高到95 ℃，熒光信號在循環結束時檢測，每個樣品做3 個生物學重復。

1.7 高通量檢測MyoD1啟動子區甲基化

依據原始提供的牛MyoD1啟動子區區域進行引物設計(表2)，選取檢測位置區域(NC_037342.1)將樣品送往重慶擎科生物科技有限公司進行高通量測序。

表2 甲基化測序引物序列

1.8 統計分析

運用Excel 2010軟件對各組織中目的基因和內參基因mRNA表達量進行處理，運用2-ΔΔCt法計算。采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進行數據處理(SPSS 21.0)，多重比較采用Duncan’s多重極差檢驗法，運用Graphpad6 作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 間接免疫熒光細胞鑒定

如圖1所示，Desmin抗體發生特異性結合，呈陽性反應顯紅色，細胞核在DAPI的染色下呈藍色，Merge后能完全重合，表明培養的細胞為成肌細胞。

A.DAPI核染；B.Desmin染色；C.合圖Merge；D.DAPI核染對照；E.不加Desmin一抗對照染色

2.2 CCK8檢測不同濃度5-Aza-dC對成肌細胞增殖的影響

本試驗在成肌細胞中添加不同濃度的甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC后，用CCK8檢測0、24、48 h成肌細胞增殖情況。表3可以看出，與對照組相比，成肌細胞中添加0.05或0.1 μmol·L-15-Aza-dC時細胞存活率呈上升趨勢，但是隨著濃度增加細胞存活率逐漸下降，其中0.3 μmol·L-15-Aza-dC濃度下細胞存活率極顯著下降(P<0.01)；處理24 h后，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理細胞的存活率呈顯著上升(P<0.05)，在0.1 μmol·L-1存活率最高。處理48 h后，細胞存活趨勢與24 h相同，但是同24 h相比提高不明顯。表明0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組適合用于后續試驗。

表3 不同濃度5-Aza-dC對細胞存活率的影響

2.3 流式細胞儀檢測成肌細胞凋亡

從圖2可知，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細胞凋亡率較空白組極顯著增加(P<0.01)。為進一步檢測甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC是否與Bcl、Bax、Caspase-9等細胞凋亡因子有關，通過qRT-PCR檢測，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細胞能夠極顯著的降低細胞抗凋亡因子Bcl的表達(P<0.01)，極顯著的提高促凋亡因子Bax表達(P<0.01)，顯著提高促凋亡因子Caspase-9的表達(P<0.05)。

A.空白組細胞凋亡；B.試驗組細胞凋亡；C.細胞凋亡率；D.細胞凋亡因子mRNA的表達。Q1.機械性損傷細胞；Q2.晚期凋亡細胞；Q3.正常細胞；Q4.早期凋亡細胞

2.4 流式細胞儀檢測成肌細胞周期

通過流式細胞儀檢測0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的細胞及空白組細胞，結果顯示(圖3)，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組G0/G1期細胞比例較高于空白組，但差異不顯著(P>0.05)，S期及G2/M期細胞低于空白組，差異也不顯著(P>0.05)。為進一步檢測甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC對細胞周期相關因子CyclinB1、CyclinA2、CyclinD 表達的影響，通過qRT-PCR檢測相關細胞因子的表達，發現5-Aza-dC顯著的提高了周期因子CyclinA2的表達(P<0.05)，對細胞因子CyclinB1、CyclinD的表達影響不顯著(P>0.05)。

A.空白組細胞周期；B.試驗組細胞周期；C.細胞周期不同時期比例；D 細胞周期因子mRNA的表達

2.5 qRT-PCR 檢測MyoD1、DNMT1 mRNA相對表達量

2.5.1 PCR擴增結果 由圖4可知，PCR擴增產物條帶清晰，沒有拖帶和二聚體，片段大小符合試驗預期。

A.關嶺牛MyoD1基因熒光引物電泳圖；B.關嶺牛DNMT1基因熒光引物電泳圖。M.DNA相對分子質量標準

2.5.2 Real-time PCR 檢測結果擴增曲線和峰圖 由圖5、圖6、圖7可知設計的引物通過實時熒光定量PCR檢測，擴增曲線拐點清晰，熔解曲線均為單峰，無雜峰，引物特異性好。

A.MyoD1擴增曲線；B.MyoD1熔解峰

A.DNMT1擴增曲線；B.DNMT1熔解峰

A.GAPDH擴增曲線；B.GAPDH熔解峰

2.5.3MyoD1、DNMT1基因表達分析 由圖8可知，空白組中MyoD1的mMRNA的表達量極顯著低于試驗組的表達量(P<0.01)，DNMT1的表達量也極顯著低于試驗組(P<0.01)。

A.MyoD1相對表達量；B.DNMT1相對表達量

2.6 MyoD1啟動子區甲基化檢測

由表4可知，處理48 h后，空白組的MyoD1啟動子區CpG甲基化率為28.0%，CHG甲基化率為2.0%，CHH甲基化率為1.9%，試驗組的MyoD1啟動子區CpG甲基化率為19.8%，CHG甲基化率為1.3%，CHH甲基化率為1.8%。并且0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理的試驗組極顯著的降低了MyoD1啟動子區的甲基化率(P<0.01，圖9)。

表4 5mC 位點覆蓋統計

圖9 MyoD1基因啟動子甲基化率

3 討 論

DNA甲基化作為一種相對穩定的修飾狀態，在DNA甲基轉移酶的作用下，可隨DNA的復制過程遺傳給新生的子代DNA，是一種重要的表觀遺傳機制[21]。DNA甲基化通過DNA甲基轉移酶(DNA methylthansferase，DNMT)來實現，并分為2類，即維持DNA甲基化轉移酶(DNMT1)和從頭甲基化酶[22-24]。隨著對DNA甲基化的繼續深入研究，發現一些可以抑制甲基化酶的藥物，甲基化酶抑制劑是一種嘧啶核苷類似物，可以致使多種抑癌基因重新激活恢復功能，重新發揮抗腫瘤的作用，以及誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長，因而有其廣闊的臨床應用前景，應用較廣泛的是甲基化抑制劑5-氮雜-2甲基脫氧胞苷(5-Aza-dC)。利用藥物手段調節DNA甲基化水平可以幫助了解基因甲基化對其的影響。

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除冗余或異常細胞中起著必要的作用，在生物體進化、內環境穩定以及多個系統發育中起著重要作用[25-27]。Kiianitsa等[28]發現，PARP1在5-Aza-dC處理的人成纖維細胞中形成共價DNA加合物并可以誘導凋亡，阻斷DNA復制。Shire等[29]發現，5-Aza-dC恢復了SULF1陰性細胞系中SULF1 mRNA的表達，與此相關的是硫酸酯酶活性的增加和促進肝癌細胞凋亡。李瑾[30]研究發現，5-Aza-dC通過影響DNA甲基化水平，引起細胞周期阻滯，使細胞發生凋亡從而具有抗腫瘤作用。

吳元等[31]用5-Aza-dc處理T24細胞，結果發現，Bcl2蛋白表達降低，Bax、Cleaved Caspase-3表達上升，但不顯著。Kiianitsa等[32]發現，在5-Aza-dC處理的人成纖維細胞中PARP1形成共價的DNA加合物并誘導細胞凋亡。而本試驗在牛成肌細胞中添加不同濃度的甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC后，用CCK8檢測0、24、48 h細胞增殖情況。結果顯示，0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組是本試驗組中最適濃度并用于后續試驗，通過流式細胞儀對細胞凋亡和細胞周期進行檢測，發現0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理組能夠極顯著促進成肌細胞凋亡(P<0.01)；對細胞凋亡因子檢測表明，該濃度極顯著地降低細胞抗凋亡因子Bcl的表達(P<0.01)，極顯著地提高了促凋亡因子Bax表達(P<0.01)，顯著提高了促凋亡因子Caspase-9的表達(P<0.05)；這表明5-Aza-dC能夠極顯著促進關嶺牛成肌細胞的凋亡。同時對細胞周期的檢測發現，5-Aza-dC對細胞周期的影響差異不顯著(P>0.05)，為進一步驗證5-Aza-dC對細胞周期的影響，通過qRT-PCR發現，周期因子CyclinA2表達顯著提高(P<0.05)，而細胞因子CyclinB1、CyclinD表達未發生顯著變化(P>0.05)。李鳳珍[33]研究發現，低濃度范圍的5-Aza-dC(0.005 μmol·L-1)不會顯著的影響細胞周期。李瑾[30]研究發現，10 μmol·L-1的5-Aza-dC處理人肺癌細胞A549 48 h后，人肺癌細胞A549細胞周期阻滯于G2/M期，且細胞內的活性氧水平顯著升高(P<0.05)。本試驗發現，使用0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理后，周期因子CyclinA2的表達顯著提高(P<0.05)，推測可能是由于5-Aza-dC濃度偏高。細胞凋亡和細胞周期都是維持體內細胞數量動態平衡的基本措施以及維持胚胎正常發育、機體健康的基本生物學現象[34-37]。本研究發現，5-Aza-dC能夠促進細胞凋亡，但是對于細胞周期影響不明顯，對于5-Aza-dC的最適濃度和時間還要進一步驗證。

MyoD1基因在調節肌肉細胞的生長、代謝及促進肌肉細胞的增殖、分化等功能上均具有的重要作用[38]。Megiorni等[39]發現，5-Aza-dC處理后的DNA去甲基化能夠上調miR-378a-3p水平，提高MyHC基因表達量。MyoD1同是重要的肌肉發育基因，通過0.1 μmol·L-15-Aza-dC處理細胞后發現，試驗組極顯著的降低MyoD1啟動子區的甲基化率(P<0.01)。而空白組中MyoD1的mRNA的表達量極顯著低于試驗組(P<0.01)，同時也發現，DNMT1的表達量極顯著低于試驗組(P<0.01)。可能由于5-Aza-dC的作用主要是在 DNA復制過程中能夠與甲基轉移酶(DNMTs)結合形成共價復合物而達到去甲基化，能夠明顯抑制該酶的甲基轉移活性但是并不影響DNMTs表達。本研究結果提示，5-Aza-dC通過調節Caspase-9、Bcl、Bax和CyclinA2 mRNA表達水平影響牛成肌細胞的增殖和凋亡，并且低濃度水平5-Aza-dC(0.1 μmol·L-1)極顯著降低了MyoD1啟動子區甲基化水平。

4 結 論

本研究發現，5-Aza-dC能夠通過改變Caspase-9、Bcl、Bax、CyclinA2等基因的表達來調節關嶺牛成肌細胞的增殖、凋亡。檢測發現，0.1 μmol·L-15-Aza-dC能極顯著降低MyoD1基因啟動子區甲基化水平(P<0.01)，極顯著提高其mRNA的表達量(P<0.01)。因此，低濃度水平5-Aza-dC(0.1 μmol·L-1)能有效降低成肌細胞中MyoD1啟動子區甲基化水平進而提高MyoD1 mRNA的表達量。所以，低濃度的5-Aza-dC能通過促進細胞凋亡及調控關嶺牛MyoD1的甲基化水平來調控MyoD1的表達；同時，MyoD1啟動子甲基化可作為遺傳標記，為后續關嶺牛的品種改良提供理論依據。