番鴨產蛋各期肝脂肪酸組成及AMPK信號通路基因表達研究

朱文俊，陳興勇,2*,劉 樂，劉政權，趙羽彤，耿照玉,2

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036；2.安徽農業大學 地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，合肥 230036)

番鴨為優良瘦肉型鴨，具有肉質好、蛋白質含量高、耐粗飼、生長快和體型大等特點。因其產蛋量低，且在個體間存在顯著差異，所以，番鴨產蛋等繁殖性狀成為了當前研究的焦點[1-3]。研究普遍認為，禽類產蛋主要受體內激素水平的影響，肝在雌激素刺激下合成大量脂質物質釋放入血液中[4-6]。番鴨肝非靶向代謝組學研究表明，產蛋期差異代謝物主要由脂類和有機酸類代謝物組成[3]。Li等[7]通過轉錄組學揭示雞產蛋前后肝轉錄組譜差異，發現差異表達基因主要富集于膽固醇合成、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路和不飽和脂肪酸合成等脂質代謝通路。可見，產蛋性狀是家禽生產中的重要經濟性狀之一，受到脂肪沉積調控[8]。

脂肪酸在肝中通過肝細胞從血漿吸收和從頭生物合成而積累，與甘油組裝成甘油三酯[9]。甘油三酯為脂肪酸在細胞和血漿中儲存和運輸的主要形式，在極低密度脂蛋白(VLDL)形成早期和末期與其結合[9]，形成富含甘油三酯的VLDL，并分泌至血液，以脂滴形式儲存于腹部脂肪、皮下脂肪、頸部脂肪和腸系膜脂肪[10]。不同于哺乳動物，禽類約90%脂質于肝中合成。肝作為家禽機體重要代謝器官，在脂質合成、轉運和代謝過程中發揮關鍵作用[11-13]。在產蛋期，肝合成蛋黃靶向型VLDL(VLDLy)通過血液轉運至卵巢組織并沉積于卵黃中，促進各等級卵泡生長發育[4]。家禽肝在產蛋期間體積增大以合成大量卵黃脂質，來滿足產蛋期間卵黃脂質沉積需求，肝顏色因脂質積累也逐漸變為黃色[14]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為脂質合成代謝主開關，在膽固醇合成、脂肪酸氧化、脂肪酸合成和VLDL合成等脂質代謝中發揮重要調控作用。活化AMPK可導致乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、HMG-CoA還原酶(HMGR)和脂肪酸合成酶(FSH)磷酸化，從而抑制肝中脂肪酸和膽固醇的生物合成[15-16]。因此，探究肝脂肪酸組成及AMPK信號通路對解釋肝在產蛋各期脂質代謝具有重要意義。

本研究旨在了解番鴨產蛋各期血脂水平、肝組織學結構、肝AMPK信號通路基因表達和其脂肪酸組成，為番鴨肝脂質代謝應答產蛋提供機理研究。同時，為產蛋期番鴨合理的飼糧營養水平監控、合理的脂肪貯存與營養調控提供借鑒，以期提高番鴨產蛋量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣品采集

白羽母番鴨飼養于安徽安慶永強農業開發股份有限公司，22周齡種鴨光照時間為11 h·d-1，采食量為103 g·d-1；30、40和60周齡種鴨光照時間為17 h·d-1，采食量為160 g·d-1，各飼養階段營養水平均按國家研究委員會(NRC)標準進行[17]。分別于產蛋前期(22周齡，(2 152±73)g)、產蛋初期(30周齡，(2 735±92)g)、產蛋中期(40周齡，(2 760±94)g)和產蛋末期(60周齡，(3 100±105)g)隨機選取健康母番鴨各15羽，禁食12 h后翅靜脈采血并分離血清。屠宰后，收集肝右葉樣本于脂肪固定液中保存。快速收集肝右葉樣本于液氮中保存，后轉移至超低溫冰箱中儲存備用。

1.2 血脂指標濃度測定

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂指標濃度由北京北方生物技術研究所有限公司測定。極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)濃度測定參照ELISA試劑盒說明書進行(H249，南京建成生物工程研究所)。

1.3 肝HE和油紅O染色

肝標本固定后，進行脫水、石蠟包埋、切片、染色等處理。切片制作由武漢賽維爾生物科技有限公司(中國武漢)完成。使用光學顯微鏡(IX73, Olympus, Japan)觀察切片。ImageJ(V1.58，USA)用于測定切片中脂滴所占比例。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

肝組織總RNA提取參照總RNA提取試劑盒說明書進行(10606ES60，上海翊圣生物科技有限公司)。瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000(Thermo Fisher公司，USA)用于檢測提取總RNA的完整性和濃度。cDNA合成試劑盒(11123ES60，上海翊圣生物科技有限公司)逆轉錄2 μg RNA為cDNA后，-80 ℃保存，直至qRT-PCR分析。

1.5 實時定量PCR(qRT-PCR)分析

根據GenBank中綠頭鴨LKB1、AMPKα1、HMGR、ACC1、SREBP1c、HNF4α、CPT1、FAS和內參β-actin序列設計熒光定量PCR引物。引物序列及目的片段長度見表1。引物序列由通用生物公司合成。熒光定量采用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(11202ES08，上海翊圣生物科技有限公司)在ABI-7500儀器(Thermo Fisher公司，USA)進行。qRT-PCR反應體系(10 μL)：5 μL Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix，上游和下游引物各0.2 μL，0.6 μL cDNA，4 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，重復40個循環。熔解曲線階段按照儀器默認設置進行。采用2-△△CT法計算mRNA相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.6 肝脂肪酸測定

脂肪酸測定參照國標GB5009.168—2016[18]方法進行，并做適當修改。準確稱取1.5 g肝組織轉移至10 mL離心管。加入0.66 mL C11∶0內標(1 mg·mL-1)、0.66 mL 95%乙醇和1.33 mL純水，于全自動樣品快速研磨儀中60 Hz研磨2 min。轉移混合物至含有33 mg焦性沒食子酸、33 mg沸石和3.3 mL鹽酸(8.3 mol·L-1)燒瓶中。75 ℃水浴孵育40 min后，加入3 mL 95%乙醇、10 mL乙醚和石油醚混合物(V∶V = 1∶1)。振搖5 min后轉移至分液漏斗中靜置5 min，收集醚層提取液。重復上述步驟3次，將提取液轉移至旋轉蒸發儀濃縮至干，殘留物即為脂肪提取物。加入1.6 mL 2% NaOH-甲醇溶液，80 ℃水浴孵化3 min。加入1.4 mL 15%的三氟化硼甲醇溶液，繼續80 ℃水浴孵化3 min。待燒瓶冷卻至室溫后，加入正庚烷2 mL，振搖5 min，再加入3 mL 飽和氯化鈉水溶液，靜置5 min。吸取上層正庚烷提取液1.5 mL至含有0.6 g無水硫酸鈉的離心管中，振搖1 min并靜置5 min后，吸取上清液1 mL，經0.22 μm有機相濾器過濾后至進樣瓶中待測定。

脂肪酸甲酯分離參照陳興勇等[19]的方法進行，并做適當修改。樣品由安捷倫7890A氣相色譜儀(安捷倫技術公司，USA)分析。色譜柱為DEGS毛細管柱(DB-WAX, 30 m×0.25 mm×0.25 mm)。柱溫箱參數設置如下：初始柱溫為60 ℃，保持2 min后，以15 ℃·min-1升高至200 ℃，然后以3 ℃·min-1升高至230 ℃，保持19 min。載氣為高純氮氣，流速為0.8 mL·min-1。進樣口和檢測器溫度為240 ℃，進樣體積為1 μL，分流比為10∶1。使用37種 脂肪酸甲酯標準品(CDAA-252795，上海安譜實驗科技有限公司)定性脂肪酸。使用C11為內標，通過公式計算各脂肪酸含量，計算公式參照國標GB5009.168—2016進行[18]。同時計算SFA、MUFA、PUFA和UFA含量。

1.7 數據統計分析

采用SPSS 20.0 單因素方差分析對試驗數據作統計與分析，數據以“平均值±標準誤”表示，若無特殊說明，樣品均為15個重復。

2 結 果

2.1 番鴨產蛋各期血脂水平分析

番鴨產蛋各期血脂水平如圖1所示，TC和LDL-C水平在40周齡顯著高于22、30和60周齡(P<0.05)；TG和VLDL-C水平在各產蛋期變化規律相似，在30和40周齡顯著高于22和60周齡(P<0.05)，并在40周齡均達到最大值；30和40周齡番鴨HDL-C水平顯著低于22和60周齡(P<0.05)。

柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 番鴨產蛋各期肝組織學結構分析

肝HE和油紅O染色切片可觀察到，22周齡時，肝呈實質狀，此時肝細胞間無可明顯觀察的脂滴。30周齡時，番鴨肝細胞間有少量脂滴產生，至40周齡時，細胞間脂滴明顯增多，60周齡時肝細胞間脂滴顯著增加呈空泡狀，經油紅O染色呈連片紅色。相對脂滴率在40和60周齡顯著高于22和30周齡(P<0.05，圖2)。

a.HE染色切片；b.油紅O染色切片；c.相對脂滴率。HE染色切片中，不同大小白色空泡代表脂滴；油紅O染色切片中，紅色圓圈滴代表脂滴(n=3)

2.3 產蛋各期番鴨AMPK通路基因表達分析

各基因在產蛋各期的表達量如表2所示，LKB1在30周齡表達量顯著低于22、40和60周齡(P<0.05)；CPT1在30、40和60周齡表達量顯著高于22周齡(P<0.05)；FAS在22和40周齡表達量顯著高于30周齡(P<0.05)；AMPKα1、HMGR、HNF4α、ACC1和SREBP1c在40周齡表達量顯著高于22和30周齡表達量(P<0.05)。

AMPK通路基因在產蛋各期表達量如表2所示。番鴨產蛋各期AMPKα1均處于本底水平低表達，并顯著低于產蛋各期CPT1和FAS表達量(P< 0.05)。番鴨22、40和60周齡肝FAS在AMPK通路各基因中的表達量最高。HNF4α和SREBP1c在產蛋各期表達量均處于較低水平。

表2 番鴨產蛋各期肝AMPK信號通路基因mRNA表達

2.4 番鴨產蛋各期肝脂肪酸組成分析

番鴨肝脂肪酸主要由13種脂肪酸組成(圖3)。產蛋各期肝組織中SFA、MUFA和PUFA主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1 和C20∶2 n-6構成，分別占總脂肪酸含量的32%、16%、30%和9%。C14∶0、C16∶0含量在40周齡顯著高于22周齡(P<0.05)；C24:0在60周齡含量為0.23 g·100 g-1，顯著高于22、30和40周齡(P<0.05)；C20∶2 n-6和∑PUFA含量在60周齡顯著高于22和40周齡(P<0.05，表3)。

表3 產蛋各期番鴨肝脂肪酸組成(n=3)

圖3 肝樣品GC-MS總離子圖

3 討 論

3.1 番鴨產蛋各期血液脂質水平變化規律

番鴨產蛋期卵泡生長迅速，需要從血液中攝取大量極低密度脂蛋白和卵黃蛋白原等脂類物質[3]。TC為血液中所有脂蛋白所含膽固醇總和，HDL具有促進多余膽固醇從周圍組織運輸回肝，并最終排出體外的功能，LDL可將膽固醇從肝運輸至外周組織細胞[20-21]。禽類40周齡體成熟，蛋重達到平均蛋重，蛋重增加同時伴隨蛋黃重增加，需要肝向血液中輸出大量卵黃脂質，因此，番鴨在40周齡時血液中TC和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低。血液中的TG在肝中合成，主要以VLDL形式運輸，最后以卵黃靶向的小型VLDLy的形式沉積在卵黃中[4]，故血清中TG和VLDL-C水平在各產蛋期變化規律相似，且在30和40周齡水平顯著高于22和60周齡。

3.2 番鴨肝脂肪沉積受日齡影響

不同于哺乳動物，禽類脂質約90%于肝中合成。脂滴是脂質和能量穩態中心的貯藏細胞器，能促進不同細胞器之間的協調和溝通，并為細胞代謝的重要樞紐[22]。脂肪肝的產生受飼料、飼喂的影響，隨日齡增加，亦會受肝臟代謝能力減弱的影響。番鴨開產后，隨著機體發育成熟和飼料攝入量增加，肝合成部分脂質轉化為脂滴以滿足卵泡增長需要。產蛋末期，肝中甘油三酯生物合成速度超過VLDL分泌至血液及肝內脂肪酸氧化速度，過量的甘油三酯在肝積聚成脂滴。因此，隨著番鴨產蛋時間的增長，肝脂滴逐漸增大。

3.3 番鴨產蛋各期AMPKα1低表達以滿足肝脂質合成需要

AMPK作為代謝主開關，已證實能夠顯著降低肝脂質生成相關基因的表達，從而抑制肝脂質生成[23]。CPT1為AMPK信號通路下游基因，為線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶[24]。從產蛋初期到產蛋結束，肝為滿足機體能量需求和脂質合成需要，處于新陳代謝旺盛期。因此，CPT1在產蛋各期表達量較高。AMPK活化可抑制FAS表達，從而抑制肝脂肪酸合成[23]。本試驗中，AMPKα1本底水平低表達，以及FAS高表達，提示產蛋期肝脂肪合成可能是通過抑制AMPKα1進而促進FAS表達得以實現。22周齡時，卵巢原始卵泡激活，開始從血液中吸收大量富含蛋白質的卵黃物質，以發育成等級前卵泡，為卵泡選擇做準備[25]，40周齡時處于產蛋高峰期，需要大量卵黃前體物來滿足卵泡快速生長需要，因此，FAS在22和40周齡表達量顯著高于30周齡。SREBP1c為一種關鍵的脂肪生成轉錄因子，它直接激活多個基因的表達，促進脂肪酸攝取和甘油三酯合成[26-27]。ACC1為肝脂肪從頭合成的限速酶，抑制肝ACC1表達會減少脂肪生成，增加脂肪酸氧化[28]。HMGR為膽固醇生物合成途徑中關鍵的限速酶[29]。HNF4α為一種核受體蛋白，通過轉錄調控與VLDL分泌相關的基因，在維持肝脂質穩態中發揮重要作用[30]。卵泡快速生長需要肝脂質和固醇類等物質，故40周齡SREBP1c、ACC1、HMGR和HNF4α表達量顯著高于22和30周齡。SREBP1c和HNF4α在產蛋各期表達量較低可能表明其在肝脂肪酸合成中起輔助作用。

3.4 番鴨產蛋中后期肝脂滴中長鏈脂肪酸增加

脂肪酸為TG和VLDL等脂類物質重要組成部分，也是脂肪酸β-氧化的底物[31]。動物和植物組織中，以16和18個碳原子的脂肪酸最為豐富[31]，故本試驗中SFA主要由C16∶0和C18∶0組成，MUFA主要由C18∶1組成。C16∶0為TG和VLDL脂肪酸的重要組成部分，分別占總脂肪的25%和25.5%[32-33]。而TG和VLDL為產蛋期肝合成的重要脂類物質，因此C16∶0在40周齡含量顯著高于22周齡。產蛋末期，肝臟中脂滴含量高于開產前、產蛋初期和產蛋中期，可能導致C24∶0含量在60周齡顯著高于其他3個時期，以及C20∶2 n-6含量在60周齡顯著高于22和40周齡。∑PUFA含量在60周齡顯著高于22和40周齡可能是由于C20∶2 n-6含量在60周齡顯著高于22和40周齡所致，C20∶2 n-6在PUFA中所占比例最高。

4 結 論

番鴨產蛋中期血清TC、TG、LDL-C及VLDL-C等血脂水平顯著增加，且肝脂滴沉積明顯。產蛋期通過下調AMPKα1表達，促進肝脂質合成相關基因FAS等表達上調，刺激長鏈脂肪酸合成，形成脂滴沉積于肝，并分泌至血液以增加血脂水平。