基于分子對接技術探討丹參酮Ⅱ A治療糖尿病神經病變的結合作用機制

李浩月 鐘達源 鄧奕輝

湖南中醫藥大學臨床醫學院，湖南長沙 410208

2 型糖尿病是一種常見疾病，有研究預測2025 年全世界將有3.8 億糖尿病患者[1]，其中15%[2]合并有糖尿病神經病變，多出現慢性疼痛[3]。目前用于糖尿病神經病變治療的藥物有多種，但臨床療效欠佳[4]，故尋找新的糖尿病神經病變的治療方法是關鍵。糖尿病神經病變歸屬于中醫的“消渴”“血痹”等范疇。段力等[5]研究發現，2 型糖尿病周圍神經病變是本虛標實，其中標實以血瘀為主。研究[6]表明，丹參酮Ⅱ A 與胰島素聯用能有效抑制周圍神經細胞凋亡，升高線粒體膜電位，抑制Bax 和Cytochrome C 轉位，還能抑制IκB 蛋白磷酸化和核因子-κB 活化，從而抑制促炎性細胞因子的表達[7]，可見丹參酮Ⅱ A 有活血化瘀的功效。目前丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變起效的具體機制尚未清晰，因此本文通過網絡藥理學研究方法進行預測，為其后續的機制研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數據庫來源及軟件

PubChem 數據庫[8]、PharmMapper 數據庫[9]、CTD數據庫[10]、Cytoscape 3.6.1 軟件、OpenBabel-2.4.1 軟件、chimera1.14 軟件、IGEMDOCK 軟件、Pymol 軟件、DAVID 數據庫[11]、STRING 數據庫[12]、PDB 數據庫[13]。

1.2 丹參酮Ⅱ A 靶點的收集及處理

通過PubChem 數據庫查找丹參酮Ⅱ A 的結構并將其導入PharmMapper 數據庫以預測其作用靶點；將靶點名注釋后通過STRING 數據庫構建蛋白互作網絡；通過CTD 數據庫檢索糖尿病神經病變疾病靶點，將蛋白互作網絡中的靶點與疾病靶點相交取共同子集，即得到丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的靶點。

1.3 丹參酮Ⅱ A 與疾病靶點的分子對接

通過PDB 數據庫下載靶點蛋白的pdb 結構文件并通過chimera1.14 軟件進行去配體加氫處理，其次通過PubChem 數據庫下載丹參酮Ⅱ A 的sdf 格式文件，再通過OpenBabel-2.4.1 轉換成pdb 文件，最后再通過chimera1.14 軟件去配體加氫處理后通過IGEMDOCK 軟件計算丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白的分子對接結合評分。再通過Pymol 軟件進行丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白結合的可視化。

1.4 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變關鍵靶點的GO及KEGG 通路分析

將丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的靶點通過DAVID 數據庫進行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析；設定顯著程度P<0.05。

2 結果

2.1 丹參酮Ⅱ A 靶點的預測與篩選

通過PubChem 數據庫查找丹參酮Ⅱ A 的3D 結構并將其導入PharmMapper 數據庫以預測其分子對接靶點，以Normfit >0.7 作為篩選參數進行篩選，得到丹參酮Ⅱ A 靶點17 個，分別是AKR1B1、ALB、CASP3、CCNA2、CDK2、EGFR、KDR、MAOB、MAPK1、MAPK14、MAPK8、MMP13、MMP3、NOS3、PPARD、PPARG、RXRA。

2.2 丹參酮Ⅱ A 與靶點蛋白的分子對接得分及結構

將丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點蛋白進行分子對接，結果顯示丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點分子對接評分均＜-6 分，提示丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點對接良好。見表1。對接結構見圖1。

圖1 丹參酮Ⅱ A 與10 個靶點蛋白的分子對接結構

表1 丹參酮Ⅱ A 與17 個靶點蛋白的分子對接得分表

2.3 GO 富集分析

將17 個丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的靶點通過DAVID 數據庫進行GO 富集分析，以P <0.05進行篩選，發現丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變主要涉及肽基絲氨酸磷酸化、脂多糖介導的信號通路、凋亡過程的負調控等25 個相關生物功能。見表2。

表2 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的GO 富集分析結果

2.4 KEGG 富集分析

將17 個丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的靶點通過DAVID 數據庫進行KEGG 富集分析，以P <0.05進行篩選，結果顯示丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變主要涉及TNF 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等19 條通路；其中PI3K-Akt信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、FoxO 信號通路富集的靶點最多，以這幾條通路進行驗證的成功率較高。見表3。

表3 丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的KEGG 富集分析結果

3 討論

糖尿病是一個快速增長的慢性系統性疾病，2013 年我國糖尿病患病率已高達10.4%[14]，2016 年全球糖尿病患者約3.82 億[15]。糖尿病又分為1 型糖尿病和2 型糖尿病，雖然這兩種類型糖尿病的發病機制不同，但它們都會導致共同的結果，即高血糖。一旦高血糖發生，兩種類型糖尿病患者都有可能發展成同樣的慢性并發癥。其中以神經病變最為易見，患病率約為50%[16]。目前針對該病多在控制血糖的基礎上，輔以營養神經的藥物方式來干預，從而改善癥狀，但該方式未能根治[17]。且由于治療的長期性，患者的醫療負擔較重。中醫藥是我國寶貴的醫療寶庫，其中記載了大量糖尿病神經病變的理法方藥，在疾病癥狀改善及預后方面均有不俗的效果，中醫藥有可能是糖尿病神經病變新的治療思路來源。

中醫本病屬于“消渴”“血痹”的范疇，病機主要包括陰陽氣血虧虛和痰瘀內積兩個方面，丹參酮Ⅱ A 是從丹參的根中分離出的二萜醌，有活血化瘀的功效。動物實驗研究[18]發現，丹參酮Ⅱ A 可以通過抑制內質網應激的激活來減輕神經元凋亡，并改善學習和記憶；劉勇等[6]發現丹參酮Ⅱ A 聯用胰島素能顯著改善糖尿病周圍神經病變大鼠的糖代謝紊亂；還有研究[19]發現丹參酮Ⅱ A 能夠通過減輕炎癥反應來改善糖尿病神經病變大鼠的癥狀，這可能與背根神經節的過度興奮及鈉通道蛋白表達的干預有關[20]；另外有研究[21]認為可能與Nrf2/ARE 信號通路的激活有關。這些研究均顯示丹參酮Ⅱ A 對糖尿病神經病變具有確切療效。

然而糖尿病神經病變是一個復雜的疾病，其與多個靶點、多條途徑及多個臟腑均存在聯系，因此具體分析丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的機制難度較大。網絡藥理學是研究藥物作用機制的新模式[22-23]，可以通過網絡化模型對丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的靶點、代謝途徑及分子機制進行精細化分析。通過該方法，本研究發現丹參酮Ⅱ A 具有多靶點特性，主要涉及肽基絲氨酸磷酸化、凋亡過程的負調控、轉錄的正調控等25 個相關生物功能，涉及的信號通路有TNF 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路等19 條通路，其中PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、FoxO 信號通路，以這幾條通路進行驗證的成功率較高，而這也得到了實驗證據[24-28]的支持。本研究結果可以為丹參酮Ⅱ A 治療糖尿病神經病變的機制研究提供重要參考和依據。