基于網絡藥理學探究丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死的作用機制

陳 中 鄭 陽 仇湘中 張信成 尹晨東

1.湖南中醫(yī)藥大學研究生院，湖南長沙 410006；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院骨傷科，湖南長沙 410006

股骨頭壞死是指因各種原因導致股骨頭血供中斷或減少，引起局部骨細胞缺血、變性、壞死，骨結構破壞，最終導致股骨頭塌陷的嚴重骨關節(jié)炎[1]。我國股骨頭壞死發(fā)病率逐漸年輕化[2]。洪坤豪等[3]、王丹丹等[4]、黃佳敏等[5]采用數據挖掘技術發(fā)現丹參、骨碎補出現頻率較高，郭會卿、仇湘中等骨傷名家也將丹參、骨碎補作為其治療股骨頭壞死的核心藥對[6-7]。由此可見，丹參-骨碎補藥對在中醫(yī)藥治療股骨頭壞死處方中有重要作用。

1 資料與方法

1.1 丹參-骨碎補藥對的活性成分和靶點的獲取

分別以中藥名“丹參”“骨碎補”在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫下載ingredients、targets；根據ADME 篩選模型，數據標準為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。將獲得的丹參和骨碎補的genesymbol導入UNIPORT 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進行標準化處理。

1.2 股骨頭壞死相關靶點的獲取

以“Osteonecrosis of the femoral head ”為關鍵詞，物種限定為人類，分別在GeneCards、OMIM 數據庫中檢索股骨頭壞死相關靶點，獲取股骨頭壞死相關靶點信息。

1.3 丹參-骨碎補藥對與股骨頭壞死相交靶點的獲取

通過R 軟件將丹參-骨碎補藥對相關潛在靶點與股骨頭壞死的潛在靶點取交集并繪制維恩圖。

1.4 藥物-活性成分-股骨頭壞死靶點蛋白互作網絡

將丹參-骨碎補藥對活性成分及治療股骨頭壞死潛在靶點導入STRING 數據庫，選擇Multiple protein，限定物種為人，獲取靶標蛋白互作網絡關系；利用R軟件，將蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）數據導入，得知基因的連接節(jié)點數，繪制丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關鍵靶點圖。

1.5 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死潛在靶點GO和KEGG 富集分析

將藥物與疾病交集潛在靶點基因運用R 軟件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor），設定p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05對這些潛在作用靶點進行KEGG 和GO 功能富集分析，繪制GO 功能富集與KEGG 富集分析氣泡圖。

2 結果

2.1 丹參-骨碎補藥對活性成分

通過TCMSP 數據庫篩選獲得丹參有效活性成分52 個，骨碎補有效活性成分18 個，藥物活性成分包括木犀草素、山柰酚、丹參酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等70 個。見表1。

表1 丹參-骨碎補藥對有效成分

2.2 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死潛在靶點篩選結果

丹參和骨碎補共獲得158 個潛在靶點；通過GeneCards 數據庫，設置數據標準Relevance score≥8獲得股骨頭壞死靶點基因590 個，OMIM 數據庫獲得68 個，合并之后刪除重復項獲得不同的股骨頭壞死作用靶點639 個。二者映射得67 個交集靶點。見圖1。

圖1 丹參-骨碎補藥對相關潛在靶點-股骨頭壞死潛在靶點維恩圖

2.3 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死調控網絡的構建

運用Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制丹參-骨碎補藥對-股骨頭壞死調控網絡。見圖2。

圖2 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死調控網絡

2.4 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死的靶點基因蛋白互作網絡及核心靶點的篩選

運用STRING 數據庫獲取靶標蛋白互作網絡關系見圖3；將PPI 數據導入R 軟件通過網絡拓撲結構繪制丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關鍵靶點圖（圖4），圖形越大，關系越密切，篩選出11 個關鍵靶點，分別為IL-6、AKT1、TP53、VEGFA、JUN、MAPK8、TNF、MAPK3、PTGS2、CASP3、MAPK1。

圖3 丹參-骨碎補治療-股骨頭壞死靶點蛋白質-蛋白質相互作用

圖4 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關鍵靶點

2.5 丹參-骨碎補藥對與股骨頭壞死交集靶點的GO和KEGG 富集分析結果

GO 功能富集顯示靶點分子功能主要涉及炎癥、細胞代謝、核染色質、蛋白質、酶、磷酸酶受體結合等，見圖5；KEGG 通路富集分析獲得163 條通絡，經進一步篩選，主要與PI3K-Akt、MAPK、IL-17、癌癥相關通路相關，將富集靶點數最多的前20 條通路繪制成KEGG 功能富集圖，見圖6。KEGG 通路所包含基因分析顯示幾乎每條通路都有核心靶點AKT、VEGFA、TNF、MAPK 的參與。

圖5 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死靶點GO 富集

圖6 KEGG 通路富集信息

3 討論

本研究篩選出藥物有效成分包括木犀草素、山柰酚、丹參酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等。木犀草素能較好的與MMP1、MMP3 結合并下調其表達水平，抑制IL-1、TNF-α 等致炎因子水平從而緩解骨關節(jié)炎疼痛[12]。山柰酚能夠明顯提高大鼠血清Ca2+、Ⅰ型前膠原羧基端前肽水平、降低Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽含量，促進骨膠原生成減少[13]。柚皮素能顯著下調p-p65 表達水平從而抑制NF-κB 活性[14]；β-谷甾醇可下調ERK1/2 和上調Bcl-2/Bax 水平[15]，Bcl-2/Bax 蛋白在細胞凋亡信號通路中起十分關鍵作用[16]。由上可知丹參-骨碎補的有效成分可調節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子水平，減少骨細胞凋亡。

本研究通過GO 分析后推測丹參-骨碎補可通過調節(jié)細胞基因表達、抗氧化應激反應、抗炎癥因子等過程治療股骨頭壞死，其中尤以細胞生物學過程最為重要。KEGG 富集分析發(fā)現4 個核心靶點AKT、VEGFA、TNF、MAPK。AKT 主要存在于靜止細胞的細胞漿內，是PI3K 的下游效應因子，AKT 可正調節(jié)NF-κB信號通路，進而降低TNF-α、IL-1β 的表達，從而抑制細胞凋亡[17-18]；VEGFA 是VEGF 家族的一員，有研究表明[19-21]VEGFA 可上調VEGF mRNA 表達，血管內皮細胞可增加miRNA-210 脫甲基化表達，促進微血管內皮細胞活性和分化，丹參酮Ⅱ A 可誘導VEGF 表達，刺激血管修復和新血管形成[22-23]，Zhang 等[24]研究發(fā)現VEGF 還可促進MSCs 向成骨細胞分化；因此VEGF 的表達量可影響股骨頭微循環(huán)和骨組織修復再生。TNF-α 是由活化的單核/巨噬細胞產生，TNF-α可損傷血管內皮細胞導致血管功能紊亂；MAPK 包括p38、JUK、ERK 三條主要信號通路，Ma 等[25]結果表明p38 通路在TGF-β1 誘導的骨髓間充質干細胞軟骨分化中被激活，TGF-β1 可上調SOX9、膠原蛋白Ⅱ、聚集蛋白聚糖和GAG 表達水平，骨形成被抑制。現有研究發(fā)現[26]JUK1、JUK2 廣泛存在于各種組織中，JUK3僅存在于腦、心臟等，JUK 信號通路被TNF-α 等炎癥因子磷酸化后，炎癥因子的表達量也相應降低，從而發(fā)揮抗骨關節(jié)炎作用。周毅等[27]研究發(fā)現川骨片上調SANFH 家兔股骨頭組織ERK1/2 的表達、抑制JNK、p38 表達，從而促進成骨細胞的形成和抑制破骨細胞的形成，發(fā)揮治療股骨頭壞死作用。