白駁丸質量標準提升研究

陳占功 趙小偉 吳劍坤 白 燕

首都醫科大學附屬北京中醫醫院藥學部，北京 100010

白駁丸是北京市醫療機構法定制劑[1]，也是首都醫科大學附屬北京中醫醫院（以下簡稱“我院”）皮膚科常用的院內制劑（京藥制字Z20063335），其治療白癜風效果確切[2]。白駁丸處方主要包含炒蒺藜、防風、首烏藤、雞血藤、當歸、紅花、赤芍、鹽補骨脂、黑豆、陳皮10 味藥，功效為補腎活血、散風通絡，用于血瘀腎虛，風邪束表證，癥見頭暈、心悸、腰酸、畏寒，女性月經量少，皮膚色素脫失或色素減退，舌質淡，苔薄白，脈沉細、弦緊；白癜風見上述證候者。原制劑質量標準只有2 項試管反應，專屬性差，無法控制白駁丸的質量。我院作為白駁丸的使用單位，筆者研究起草了白駁丸的質量標準，定性鑒別增加了蒺藜、防風、雞血藤、紅花、黑豆的顯微鑒別和當歸、首烏藤、赤芍的薄層色譜鑒別，鑒別藥味占處方藥味的80%；同時定量分析了異補骨脂素、補骨脂素的含量，以期全面反映和控制白駁丸的質量，保障臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀（美國Agilent），DM2500 顯微鏡（德國Leica），十萬分之一XS205 超越系列專業型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），YOKO-ZS紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術開發公司），SK7210HP 型超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照藥材：當歸（120927-200613）、首烏藤（120939-200705）、陳皮（969-9302）來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品：芍藥苷（110736-200934）、異補骨脂素（110738-20313）、補骨脂素（110739-201617）來源于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 板（青島海洋化工廠）；甲醇（20200201）、乙醚（20180621）、乙酸乙酯（20191201）、正己烷（20190527）、氯仿（20170616）、甲酸（F1914077）、香草醛（20060522）、濃硫酸（20180524）、乙醇（20200211），所用試劑均為分析純；實驗用藥材飲片由我院中藥房提供；白駁丸（1904073、1912022、2002026）來源于我院。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

分別取白駁丸（1912022）適量，研磨成細粉，取少量透化后置10×40 倍顯微鏡下觀察。

2.1.1 雞血藤 雞血藤的顯微特征有棕紅色色塊，石細胞及纖維束和草酸鈣方晶等。周圍薄壁細胞中含草酸鈣方晶，草酸鈣方晶呈類雙錐形或不規則形，形成晶纖維[3-4]，本研究以晶纖維為其鑒別特征。見圖1。

圖1 晶纖維

2.1.2 炒蒺藜 炒蒺藜為果實種子類藥材，其木化的內果皮纖維特征較為獨特。內果皮纖維木化，上下層縱橫交錯排列，作為蒺藜的鑒別特征[3-4]。見圖2。

圖2 內果皮纖維

2.1.3 紅花 紅花為本方中唯一的花類藥材，以花粉粒作為其鑒別特征?；ǚ哿＞? 個萌發孔，外壁有齒狀突起，類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑60 μm 左右[3-4]。見圖3。

圖3 花粉粒

2.1.4 黑豆 黑豆的顯微特征是具有種皮珊狀細胞、種皮支持細胞、子葉細胞、草酸鈣結晶等。其中，種皮珊狀細胞紫紅色，側面觀細胞1 列，長50～80 μm，壁厚，具光輝帶且較為顯著，本研究將種皮珊狀細胞作為其鑒別特征[3-4]。見圖4。

圖4 種皮珊狀細胞

2.1.5 防風 防風的顯微鑒別特征為具有油管、葉基維管束、網紋導管、石細胞等。其中，油管直徑17～60 μm，充滿金黃色分泌物[3-4]，本研究以其作為防風的鑒別特征。見圖5。

圖5 油管

2.2 薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）鑒別

2.2.1 當歸TLC 鑒別 取白駁丸（1912022）12 g，粉碎成細粉，加甲醇30 ml 后超聲提取40 min，過濾，得到的濾液揮盡溶劑，剩余殘渣水溶解后乙醚萃取2 次，合并乙醚層，揮盡溶劑，剩余殘渣加乙酸乙酯1 ml 溶解，作為白駁丸供試液。取當歸對照藥材1 g，按以上供試液制備方法制成對照藥材溶液。另外，按白駁丸處方配比，取除去當歸的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成當歸陰性對照液。依照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC進行試驗，白駁丸供試液吸取10 μl，當歸對照藥材溶液吸取3 μl，當歸陰性對照溶液吸取5 μl，分別點于同一塊硅膠G 板上，采用正己烷-乙酸乙酯（4∶1）的展開劑展開，取出后晾干，置于365 nm 的紫外光燈下檢視，結果可見，在供試品色譜中，與當歸對照藥材色譜相應位置處可見相同顏色的熒光斑點，當歸陰性對照則沒有干擾[4-6]。見圖6。

圖6 當歸薄層色譜圖

2.2.2 首烏藤TLC 鑒別 取首烏藤對照藥材1 g，同“2.2.1”項下供試液制法制備對照藥材溶液。另按白駁丸處方，取除去首烏藤的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成首烏藤陰性對照液。按照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進行試驗，吸取“2.2.1”項下白駁丸供試液5 μl、首烏藤對照藥材溶液3 μl、首烏藤陰性對照液5 μl，分別點于同一塊硅膠G 板上，采用正己烷-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸（5∶5∶2∶0.1）展開，取出后晾干。置于365 nm 的紫外光燈下檢視，結果可見，在供試品色譜中，與首烏藤對照藥材色譜相應位置處有相同顏色的熒光斑點，首烏藤陰性對照則沒有干擾[4-8]。見圖7。

圖7 首烏藤薄層色譜圖

2.2.3 赤芍TLC 鑒別 將“2.2.1”中乙醚提取過的水層揮盡乙醚后，采用醋酸乙酯振搖萃取2 次，合并上層的醋酸乙酯層，揮盡醋酸乙酯，殘渣用甲醇1 ml 溶解作為供試液。取芍藥苷對照品用甲醇制成每毫升含1 mg的對照品溶液。另按白駁丸處方，取除去赤芍的其他藥材飲片，按白駁丸制法及供試液制法制成赤芍陰性對照液。依照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502[5]收載的TLC 進行試驗，吸取白駁丸供試液5 μl、芍藥苷對照品溶液3 μl、赤芍陰性對照液5 μl，分別點于同一塊硅膠G 板上，采用三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）展開，取出后晾干，噴以5%香草醛濃硫酸的乙醇溶液，加熱至出現清晰斑點，于日光下檢視，結果可見，在供試品色譜中，與芍藥苷色譜相應位置處有相同顏色的斑點，赤芍陰性對照則沒有干擾[4-7]。見圖8。

圖8 赤芍薄層色譜圖

2.3 白駁丸中異補骨脂素、補骨脂素的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適應性 色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（AgilentSB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40℃，流動相采用甲醇-水（55∶45）；檢測波長為246 nm[4-8]。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取適量的異補骨脂素、補骨脂素對照品適量，用甲醇制成每1 ml 含異補骨脂素20.36 μg、補骨脂素20.44 μg 的混合溶液，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取三批樣品1904073、1912022、2002026 各10 袋，粉碎成細粉，混合均勻，分別精密稱定6 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇適量，加熱回流提取2 h，冷卻后轉移至100 ml 量瓶中，用甲醇定容至100 ml，搖勻后過濾，所得濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液制備 按白駁丸處方，取除去補骨脂的其他藥材飲片，按白駁丸的制備方法及供試品溶液制備方法制成補骨脂陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性試驗 分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液和補骨脂陰性對照溶液，按照“2.3.1”項下的色譜條件來測定，記錄色譜圖，結果見圖9?？梢姳緦嶒灢捎玫纳V條件下補骨脂陰性對照無干擾，專屬性強。

圖9 補骨脂素及異補骨脂素的含量測定高效液相色譜法圖譜

2.3.6 線性關系的考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、3、6、9、12、15 μl，按“2.3.1”項下的色譜條件測定各個峰面積，繼而以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），求得異補骨脂素回歸方程Y=4585.4X-25.979（r=0.9999），補骨脂素回歸方程Y=8387.5X-17.875（r=0.9999），表明異補骨脂素在0.0204～0.3054 μg 范圍內、補骨脂素在0.0204～0.3066 μg 范圍內進樣量與峰面積積分值具有良好的線性關系。

2.3.7 精密度試驗 混合對照品溶液進樣10 μl，連續6 次，測定峰面積，結果補骨脂素峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.35%，異補骨脂素峰面積RSD 值為0.44%，表明所用儀器具有良好的精密度。

2.3.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（1912022）10 μl，分別于0、2、4、6、8 h 進樣，測定峰面積，計算補骨脂素峰面積的RSD 值為1.71%，異補骨脂素峰面積的RSD 值為1.64%，表明供試品溶液在8 h 內具有良好穩定性。

2.3.9 重復性試驗 取6 份同一批號的白駁丸樣品（1912022），分別采用“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法制備白駁丸供試品溶液，采用“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，進樣量為10 μl，測得峰面積值并計算異補骨脂素、補骨脂素含量，結果異補骨脂素含量RSD 值為1.26%，補骨脂素含量RSD 值為1.78%，重復性試驗符合要求。

2.3.10 回收率試驗 ①對照品溶液制備：分別精密稱取異補骨脂素對照品10.18 mg、補骨脂素對照品10.22 mg，放置于同一個50 ml 的量瓶中，采用甲醇定容，制成異補骨脂素0.2036 mg/ml、含補骨脂素0.2044 mg/ml 的溶液，即得。②樣品溶液制備：精密稱取6 份已知含量的同一批號白駁丸樣品（1912022），分別加入補骨脂素1 ml，異補骨脂素4 ml，其余步驟按照“2.3.3”項下供試品溶液制備方法進行操作，采用“2.3.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。見表1～2。

表1 補骨脂素回收率

表2 異補骨脂素回收率

2.3.11 樣品測定 取3 個批號的白駁丸樣品，采用“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，采用“2.3.1”項下的色譜條件進樣10 μl，測定異補骨脂素、補骨脂素的峰面積，計算其含量。見表3。

表3 三批白駁丸含量測定結果（mg/g）

3 討論

白駁丸的生產工藝為藥材細粉用水制成水丸；而中藥粉末的專屬性鑒別方法即為顯微鑒別，不僅專屬性強，更具有檢測成本低、操作簡單的特點。因此，本研究利用顯微鑒別法鑒別了雞血藤藥材的晶纖維、蒺藜藥材內果皮的木化纖維、紅花藥材的花粉粒、黑豆藥材具有光輝帶的紫紅色種皮珊狀細胞及防風藥材充滿金黃色分泌物的油管，這些顯微特征易于觀察且專屬性強。當歸、首烏藤的TLC 鑒別以乙醚提取物作為供試品，鑒別其弱極性成分，在365 nm 紫外光燈下熒光斑點清晰，陰性均無干擾。赤芍的TLC 鑒別以芍藥苷作為對照，顯色后日光下檢視，供試品色譜在相應位置上顯相同顏色斑點，陰性無干擾，重現性好。

白癜風是一種皮膚黏膜色素脫失性皮膚病[10]，具有原發性、局限性或泛發性，表現為皮膚、黏膜、毛發等的黑色素細胞出現選擇性減少甚至消失從而引發白斑、灰發或白發[11]，膚色深的人群比膚色淺的發病率高，我國人群患病率為0.1%～2.0%[12]。白癜風在祖國醫學古籍中多有記載，古今同名，且中西醫病名相同[13]。目前，現代醫學還未形成較為理想的治療白癜風的方法，而祖國醫學近年來對于本病的治療取得滿意效果[14]。大部分醫家都是在辨證論治的基礎上，借鑒現代藥理學研究的成果，以增強療效[15]。目前中醫對白癜風的病因病機的認識中，多數認為白癜風是由機體內因與外因相互作用導致的。外因主要是風邪外侵，內因是由情志內傷、肝氣郁結、氣機不暢，心火肺熱或脾胃虛弱、肝腎不足等臟腑失調，導致皮膚氣血失和，瘀阻脈絡[16]，歐陽恒認為發病機制為“氣血失和，久病成瘀”[17-18]。白駁丸具有散風活血、補腎通絡之功，臨床應用多年，療效確切。補骨脂具有溫腎助陽之功，為治療白癜風的主要藥物[19]，黃曼萍等[20]通過查閱文獻采集264 首治療白癜風的外用處方，從白癜風外用藥物頻次統計來講，補骨脂位列第一[21]，補骨脂顏色為深色，中藥色象理論是在辨證理論的基礎上加入了以色治色的思想[22]。在白癜風的治療中能夠促進黑色素細胞的遷移和黑色素合成[23-24]，補骨脂中所包含活性成分種類比較多，現已能夠分離出一些化合物[25-26]。補骨脂素屬于天然的呋喃香豆素類化合物，在抗腫瘤、抗病毒、治療白血病、治療白癜風皮膚頑疾等多方面的臨床應用廣泛[27]。

白駁丸治療白癜風，臨床應用多年。本文選擇其主要成分補骨脂素和異補骨脂素進行含量測定，方法學考察結果符合要求，方法簡便易行，專屬性良好，為臨床用藥提供質量保證。