外周血特異性腫瘤標志物mRNA表達在非小細胞肺癌微轉移中的意義

農雪萍

江西省胸科醫院病理科，江西南昌 330006

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，具有較高的病發率與病死率，發病機制主要與患者吸煙、工作環境及遺傳等因素有關，常表現為胸部疼痛、痰血、咳嗽、低熱與呼吸困難等，而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80%，術后5年生存率較低，即使是Ⅰ期患者接受腫瘤完全切除術治療后，仍有部分患者會在術后復發，而微轉移是造成患者易反復與轉移的預后指征，但該情況很難用臨床常規病理學檢測確診，常隱匿在原病灶之外的組織中[1]。逆轉錄聚合鏈反應（reverse transcription polymer chain reaction，RTPCR）技術對腫瘤細胞有較高的靈敏度，可在10 個單個核細胞中準確檢測出腫瘤細胞，是臨床實體瘤完整性中微轉移的常用措施[2-3]。本研究以RT-PCR 技術檢測外周血細胞角蛋白（cytokeratin，CK19）、肺特異性X基因（lung-specific X gene，LUNX）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）mRNA 表達情況，探究其對NSCLC 患者早期轉移的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取江西省胸科醫院病理科2019年1月—2020年11月收治的52 例NSCLC 患者，術前均進行抗腫瘤治療，排除患有其他惡性腫瘤或其他腫瘤肺部轉移者，均經臨床病理學組織確診。其中男28 例，女24例；年齡32～75 歲，平均（52.31±3.22）歲；經胸片、胸部CT掃描、B 超等檢查進行臨床分期判定：Ⅰ期17 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期14 例。以同時期入院體檢的30 例正常體檢者作為參照組，其中男16 例，女14 例；年齡30～68歲，平均（52.66±3.56）歲。兩組的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。參與者均知情并簽署同意書，且本研究已經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

于治療前抽取肺癌患者與正常體檢者的靜脈血5 mL，以淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）將有核細胞分離，清洗后，離心（離心半徑為10 cm，離心轉速為3000 r/min，離心時間為15 min）取上清液；保存在1.5 mL 無菌Ep 管中，然后加入1000 μL Trizol（Invitrogen 公司）消化，經氯仿抽提，異丙醇沉淀總RNA，經75%乙醇漂洗，氣干后加入15 μL 無菌DEPC 水將其溶解，行逆轉錄反應（嚴格遵循說明書操作）。

1.3 觀察指標

記錄兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達陽性率，具體測量方法：將10 μL PCR 產物與β-actin PCR 產物、1.7 μL 澳酚上樣緩沖液混勻，將其加入1.5%瓊脂糖凝膠上，以100 bp Ladder Marker 加樣，然后將其作為分子量標志；保持恒壓80 V，電泳40 min，行EB 染色，于UVB 凝膠成像系統下攝片，測量各條帶熒光強度。并分析細胞分化程度、TNM 分期與NSCLC患者各項外周血腫瘤標志物mRNA 表達的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。計數資料采用率表示，多組間率的整體比較采用χ2檢驗，多組間率的兩兩比較采用Bonferroni 方法矯正，檢驗水準α=原α水平/比較次數，即0.05/3=0.0167。

2 結果

2.1 兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達陽性率的比較

NSCLC 組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達陽性率均高于參照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組外周血CK19、LUNX、CEA mRNA 表達陽性率的比較[n（%）]

2.2 細胞分化程度與NSCLC 患者各項外周血腫瘤標志物mRNA 表達的關系

三種分化程度的CK19 mRNA 陽性率、CEAmRNA 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高分化程度的LUNX mRNA 陽性率低于中、低分化程度，差異有統計學意義（P＜0.0167）；而中、低分化程度的LUNX mRNA 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.0167）（表2）。

表2 細胞分化程度與NSCLC 患者各項外周血腫瘤標志物mRNA表達的關系[n（%）]

2.3 TNM 分期與NSCLC 患者各項外周血腫瘤標志物mRNA 表達的關系

三種TNM 分期的CK19 mRNA 陽性率、CEA mRNA 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Ⅲ期的LUNX mRNA 陽性率高于Ⅰ期、Ⅱ期，差異有統計學意義（P＜0.0167）；而Ⅰ期、Ⅱ期的LUNX mRNA 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.0167）（表3）。

表3 TNM 分期與NSCLC 患者各項外周血腫瘤標志物mRNA 表達的關系[n（%）]

3 討論

肺癌是目前臨床常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率，且大部分患者為NSCLC。近年來隨著臨床醫療技術與腫瘤疾病的深入研究，于早期與中期實施肺癌手術切除，可有效改善患者病情，且成功率較高，但患者5年的生存率總徘徊在20%左右[4-5]。有數據表明，NSCLC 患者預后的改善，與其腫瘤細胞轉移有密切關系[6-7]。而腫瘤轉移需多個步驟，主要是經血液循環與淋巴循環進行轉移，屬于惡性腫瘤的發展過程，可播散并存在患者的血液、淋巴、骨髓與各組織器官中，且尚未形成的轉移性結節無明顯臨床特征，經常規的病理學與影像學等方法檢測很難發現[8-9]。目前臨床針對肺癌轉移情況主要以影像學檢查與病理學檢查為主，但效果并不理想。因癌細胞可能是患者術后腫瘤全身轉移的根源，其外周血中的癌細胞則預示腫瘤具有轉移傾向，是表明患者腫瘤轉移與復發的重要表現[10-11]。目前臨床實施的外周血特異性腫瘤標志物mRNA 表達檢測NSCIC 微轉移情況，具有較高的敏感性與特異性，其標志物主要為CK19、CEA、LUNX 等[12-13]。

本研究以52 例NSCLC 患者為研究對象，以上述外周血特異性腫瘤標志物mRNA 表達為指標實施檢測，其中NSCLC 患者CK19、LUNX、CEA mRNA 的陽性率分別為38.46%、57.69%、44.23%，與參照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示若在患者外周血檢測到CK19、LUNX、CEA mRNA 表達，則表明患者體內有完整的癌細胞存活。同時對不同分化程度的NSCLC 患者腫瘤標志物mRNA 表達陽性率進行比較，結果顯示，LUNX mRNA 陽性率隨分化程度升高而降低，高分化程度患者低于中、低分化患者（P＜0.0167），而三種分化程度的CK19 mRNA 陽性率、CEAmRNA 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明LUNX mRNA 診斷效能優于CK19、CEA mRNA。對不同分期的NSCLC 患者腫瘤標志物mRNA 陽性率進行比較，發現LUNX mRNA 陽性表達率隨著臨床分期的加重而增高，Ⅲ期的LUNX mRNA 陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.0167），表明NSCLC 患者的分期愈晚，肺癌細胞脫落至血循環的危險性愈大。本研究結果證實，以LUNX mRNA 表達作為NSCLC 患者的微轉移提示指標，可發揮顯著的敏感性與特異性。而肺癌患者外周血中LUNX mRNA 表達可能來自轉移癌細胞，可準確提示腫瘤的轉移傾向，解釋了臨床部分患者早期無任何轉移征象腫瘤，經手術完整切除后仍會在短時間內復發或轉移。故LUNX mRNA 可作為NSCLC微轉移檢測的分子標志物[14-15]。雖然微轉移是形成遠處轉移的必要條件，但有少量的腫瘤細胞檢出，并不代表最終會形成顯性轉移，其中腫瘤細胞自身生物學特性、局部微循環與機體免疫等情況均是重要的影響原因，若檢測出腫瘤細胞，則預示著患者有發生轉移的危險性。隨著臨床生命科學研究的不斷深入，分子生物學技術日益完善，再加上其他新興技術的推廣，必將會為腫瘤的深入研究提供可靠條件，因此在日后需深入探究NSCLC 外周血特異性腫瘤標志物mRNA表達與微轉移的關系，對患者病程進展、預后評估與臨床指導治療有重要意義。

綜上所述，肺癌患者微轉移的臨床意義需更深層次的論證，后期需對肺癌患者進行密切隨訪，從而深入明確mRNA 陽性表達與腫瘤轉移、預后的關系。當然臨床一次的檢測結果為陰性，并不代表患者無腫瘤微轉移情況，因腫瘤細胞可間斷的脫落進入循環系統，且在短時間內會被機體的免疫系統破壞，故針對患者腫瘤細胞微轉移情況仍需多次反復檢測，從而提高診斷的準確性與特異性。