不同品種綠豆對硒脅迫的響應特性分析

崔長珍，王 鵬，屈香香，劉 暢，相微微，王建武

（榆林學院生命科學學院，陜西榆林 719000）

我國72%的縣市屬于低硒或缺硒區，生活在缺硒地區的人口有7 億之多，缺硒地區的人們每天從食物中攝入硒的量遠遠低于硒需要量的上限，而通過硒營養強化的方式來補硒是一種方便有效的途徑。綠豆（Vigna radiata）屬豆科草本植物，是人類重要的雜糧作物之一[1]，其適應性強，耐貧瘠，固氮養地，營養價值豐富，而且還具有很多種藥理作用[2]。綠豆不僅具有高蛋白、低脂肪的特性，而且具有較高的維生素和礦物質含量[3]，雖說不是主食，卻是人們經常食用的食品，開發富硒綠豆對于滿足人體的合理補硒具有更高的可行性。目前，市場上開發的綠豆富硒產品，一部分是利用亞硒酸鈉或氨基酸硒水溶制劑對綠豆進行浸泡或者噴淋處理后，使之萌發成芽苗菜，然后食用[4-7]；還有部分是利用葉面噴施法對綠豆進行補硒，通過一系列的生理生化反應，將無機硒吸入綠豆植株體內，轉化為有機硒富集在綠豆籽粒中，然后食用[8]。但針對不同品種綠豆對硒的吸收、轉運和富集方面差異研究尚未見報道。

本研究以12 種綠豆為研究對象，探究了不同品種綠豆對硒脅迫響應的生理差異，旨在為選育富硒綠豆品種提供一定理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試綠豆種子分別為維綠9 號、榆綠2 號、蘇拉2 號、中綠8 號、冀綠10 號、冀綠7 號、綠聯I17白綠-11 號、白綠6 號、保942-34、中綠3 號、橫山綠豆、天山大明綠豆2 號，共12 個，均由榆林市農業科學研究院小雜糧研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞硒酸鈉營養液的配置 用1/10 的營養液和固體亞硒酸鈉，參考MEHDAWI 等[9]的試驗方法，配制20、30 mg/L共2 種不同濃度的亞硒酸鈉營養液。

1.2.2 綠豆幼苗培養及處理 挑選籽粒飽滿、形態一致、完好無損的綠豆種子，經清洗消毒后，自然風干；采用榆林當地的黃土與蛭石1∶1 的比例配制培養土，然后每個品種選取18 粒種子，一盆種6 粒種子，3 個重復，置于光照培養間培養（溫度為24 ℃，光照強度為8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）。隨后每天觀察長勢，適時澆水；待長到三葉一心時開始用20 mg/L 的亞硒酸鈉溶液進行澆灌[10]。處理28 d 后記錄形態變化，并將地上部分和地下部分洗凈烘干，送到北京萊析檢測技術有限公司，利用ICP-MS（ThermoFisher ICAP Q）測定硒含量。

挑選籽粒飽滿、形態一致、完好無損的綠豆種子，經清洗消毒后，自然風干；然后將種子置于鋪有濾紙的培養皿中培養，待長出約1 cm 的根時，將其移栽進行水培，置于光照培養間培養（溫度為24 ℃，光照強度為8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）；待長到三葉一心時，將營養液換為亞硒酸鈉營養液，用20、30 mg/L 的亞硒酸鈉營養液處理[4]，對照組為不加硒的營養液。處理5 d 后，測定其葉片的氧化應激生理指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 形態指標測定 在同一時間、同一濃度的亞硒酸鈉營養液處理下，土培28 d 后觀察并記錄不同品種綠豆葉片顏色、莖的顏色、葉片干枯程度變化。

1.3.2 硒的富集轉運能力測定 其參考喬斌[11]的方法進行。

1.3.3 氧化應激生理指標測定 超氧化物歧化酶活性（SOD）的測定參考王學奎[12]的方法進行；過氧化物酶（POD）的測定參考裴帥帥[13]的方法進行；過氧化氫酶（CAT）的測定參考李柏林等[14]的方法進行；丙二醛（MDA）含量測定參考王曉棟[15]的方法進行。

1.4 數據處理

試驗數據采用SPSS 22.0 及WPS 2016 軟件進行方差分析與作圖；采用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉對綠豆形態指標的影響

表1 不同綠豆品種處理前后形態指標的變化

由表1 可知，不同品種綠豆對硒的耐受性不同，因而在形態變化上有明顯差異，相同處理條件下，榆綠2 號、保942-34 和橫山綠豆的葉片顏色仍為深綠色，與處理前相比基本不變，而其他品種的葉片顏色明顯變黃；綠豆莖的顏色前后并無明顯變化，只有品種間本來的莖色差異；冀綠7 號和綠聯I17 白綠-11 號干枯較為明顯，而維綠9 號、蘇拉2 號、中綠8 號、冀綠10 號、白綠6 號、保942-34和中綠3 號表現正常，沒有干枯，其他的則是整盆干枯，不同品種的干枯程度有所差異。

2.2 不同品種綠豆的富集轉運能力變化

硒含量測定結果表明（表2），不同品種綠豆葉和根中硒含量差異明顯，葉含硒量最低的品種為天山大明綠豆2 號（84.46 mg/kg），最高的品種為保942-34（317.02 mg/kg）；根含硒量最低的品種為橫山綠豆（1 107.97 mg/kg），最高的品種為冀綠7 號（2 855.92 mg/kg）。

表2 不同品種綠豆葉和根中硒含量及轉運系數

不同品種綠豆對硒的轉運系數由大到小排列為保942-34＞橫山綠豆＞維綠9 號＞榆綠2 號＞冀綠7 號＞中綠3 號＞白綠6 號＞蘇拉2 號＞綠聯I17 白綠-11 號＞冀綠10 號＞中綠8 號＞天山大明綠豆2 號（表2）。根據不同品種綠豆對硒的轉運系數大小不同，結合硒脅迫下形態指標變化，初步判斷富集硒能力最強的品種是保942-34，富集硒能力最弱的品種是天山大明綠豆2 號。篩選出這2 個品種后，進一步比較硒脅迫下，2 個品種綠豆在氧化應激生理方面的差異。

2.3 硒脅迫對2 個品種綠豆氧化應激生理指標的影響

在水培條件下，用20 和30 mg/L 的亞硒酸鈉營養液處理保942-34 和天山大明綠豆2 號2 個品種綠豆，對照組為不加硒的營養液，處理5 d 后，測定氧化應激生理指標。

2.3.1 硒脅迫對綠豆葉中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 超氧化物歧化酶（SOD）是一種清除含氧自由基的酶。從圖1 可以看出，在質量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的SOD 活性顯著高于天山大明綠豆2 號（P＜0.05）；而在質量濃度為30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號SOD 活性顯著高于保942-34（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，保942-34的SOD 活性先上升后下降，而天山大明綠豆2 號SOD 活性逐漸上升，保942-34 的SOD 活性在質量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下最大，達到75.693 U/g。

2.3.2 硒脅迫對綠豆葉中過氧化物酶（POD）活性的影響 過氧化物酶（POD）可以催化H2O2氧化分解為H2O、O2，減少H2O2對細胞生物功能分子的破壞作用。由圖2 可知，在質量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號POD 活性顯著高于保942-34（P＜0.05）；而在質量濃度為30 mg/L的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的POD 活性顯著高于天山大明綠豆2 號（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，保942-34 的POD 活性逐漸上升，而天山大明綠豆2 號POD 活性先上升后下降，天山大明綠豆2 號POD 活性在質量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下最大，達到3.24 U/g。

2.3.3 硒脅迫對綠豆葉中過氧化氫酶（CAT）活性的影響 過氧化氫酶（CAT）屬于活性氧清除劑，可以分解機體代謝過程中產生的活性氧如過氧化氫、超氧陰離子等。從圖3 可以看出，在質量濃度為20、30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的CAT活性均顯著高于天山大明綠豆2 號（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，保942-34 和天山大明綠豆2 號的CAT 活性均先下降后上升，保942-34 的CAT 活性在未加亞硒酸鈉處理下最大，達到348 U/g。

2.3.4 硒脅迫對綠豆葉中丙二醛（MDA）含量的影響 丙二醛（MDA）是植物組織在衰老或逆境條件下，發生脂質過氧化作用的終產物之一，其含量大小可以反映植物遭受逆境傷害的程度。從圖4 可以看出，在20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號的MDA 含量顯著高于保942-34（P＜0.05）；而在30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的MDA含量略高于天山大明綠豆2 號，但差異不顯著（P＞0.05）。總體而言，隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，天山大明綠豆2 號的MDA 含量逐漸下降，而保942-34 含量逐漸上升，天山大明綠豆2 號的MDA含量在未處理時含量最高，達1.32 μmol/g。

3 結論與討論

葉片膜保護酶系統主要包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶，這3 種酶的活性大小是衡量植物對逆境抗性強弱的重要指標之一[16]。CAT可以消除H2O2，從而減少H2O2的積聚，降低其對細胞的損壞作用。POD 與光合作用等有關，可以在一定情況下使H2O2還原成水，其活性會隨其他因素而產生相應的變化。SOD 是一種金屬酶，有3 種類型[17]，其會影響植物的抗逆性和衰老，也可以消除有害的自由基，并且在氧化和抗氧化反應中有著極為重要的功能[18]。本研究中，這3 種酶的活性在高質量濃度亞硒酸鈉處理時變化趨勢不同，保942-34葉中SOD 的活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高先上升而后降低，而POD 活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而升高，CAT 活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而先下降后上升；天山大明綠豆2 號葉片中SOD的活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而升高，而POD的活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而先上升后降低，CAT 活性隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而先下降后上升，CAT 活性二者表現一致。說明隨著硒脅迫的加劇，綠豆體內的H2O2含量持續升高，進而誘導CAT 活性持續升高，POD 和SOD 在植物體內參與的生理過程更多樣，不同綠豆品種POD 和SOD 對硒脅迫的響應可能存在差異；此外，保942-34 轉運系數最高，轉運系數高會造成綠豆地上部分硒積累量升高，天山大明綠豆2 號轉運系數最低，地上部分硒積累量只有保942-34 的26.66%，這2 個品種綠豆地上部分硒含量差異可能也會造成POD 和SOD 活性變化不一致。在30 mg/L 亞硒酸鈉時，保942-34 的POD 和CAT 的活性均高于天山大明綠豆2 號，清除超氧陰離子自由基的能力也最強，對硒的耐受性較好。

丙二醛的含量是衡量植物對逆境抗性的一項重要生理指標，在逆境環境中植物器官會發生膜質過氧化作用，丙二醛便是其終產物之一[19]。保942-34 葉中MDA 的含量隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而升高，天山大明綠豆2 號MDA 含量隨亞硒酸鈉質量濃度的升高而下降。保942-34 的丙二醛在亞硒酸鈉質量濃度為30 mg/L 時達到最大值，而天山大明綠豆2 號的丙二醛在亞硒酸鈉質量濃度為20 mg/L 時達到最大值，2 種綠豆相比，天山大明綠豆2 號在20 mg/L 亞硒酸鈉質量濃度時的丙二醛含量最高，說明此時膜脂過氧化作用最為嚴重，對硒的耐受性也就較差。雖然沒有證據表明Se 是植物必需的微量元素，但低劑量的Se 能促進植物的生長，顯著增強酶促和非酶促抗氧化系統的活性，并提高植物對非生物脅迫的抗性。早在1930 年，人們就發現了Se 超富集植物，主要是豆科的黃芪屬植物以及假含羞草屬植物、十字花科的雞冠花屬植物，但由于這些植物跟模式植物的親緣關系較遠，對其富硒的遺傳和分子機制研究一直沒有深入進行[20]。

本研究通過對12 個綠豆品種對硒的富集轉運能力的測定以及無機硒對其中2 種綠豆品種生理指標的測定，結果表明，不同綠豆品種對硒的吸收和轉運存在明顯差異，供試綠豆品種中保942-34硒的轉運系數最高，且對硒耐受性最好，本研究可為進一步深入研究綠豆對硒的吸收和轉運機制提供參考。已有研究證實，環境低硒是引起多種流行病的重要因素[21]，很多作物在硒生態鏈中可以將無機硒轉化為有機硒，而人和動物對有機硒的吸收和利用遠大于無機硒。本研究證實，不同品種綠豆對硒的吸收和轉運能力存在明顯差異，研究結果可為篩選富集硒能力強的綠豆品種提供參考，對缺硒地區有效防止硒缺乏癥[22]和富硒作物的推廣和利用具有重要意義，也可為通過施硒肥種植富硒綠豆提供參考[23]。