谷子粒黑穗病菌PCR 檢測體系的建立

郝雅萍，焦思薇，郭二虎，儀慧蘭

（1.山西農業大學農學院，山西太原 030031；2.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；3.山西農業大學谷子研究所，山西長治 046000）

谷子（Setaria italica）是一種重要的禾本科作物，在我國有8 000 多年的栽培歷史，屬山西省優勢雜糧作物。隨著谷子種植面積的不斷擴大，多種病害時有發生[1]，谷子黑穗病在我國的主要產區均有不同程度的發生，其中，谷子粒黑穗病是最常見的，其致病菌為粒黑穗病菌（Ustilago crameri）[2]。病菌孢子隨谷種播種進入土壤，隨后孢子萌發侵染幼苗，在植株體內蔓延，最終危害谷子穗部。被病菌侵染的籽粒因病原菌冬孢子大量形成變為黑粉，黑粉外包堅韌的灰白色膜，有一定機械強度。當谷子收獲脫粒或經風吹摩擦時，籽粒破裂散出黑粉污染種子，來年隨種子播種進入谷田。目前對谷子黑穗病的控制主要靠農藥[3]，而抗病品種的使用才是解決問題的根本。

針對不同地域病原菌生理小種的差異[4]，對抗病品種的常規篩選主要是應用形態學鑒定，通過對相同種植條件下不同品種谷子植株的感病特性進行分析比較，由發病率和發病程度判斷品種對病原菌小種的敏感或抗性[5-6]，該過程比較費時，不利于控制病害的傳播。因此，尋找一種快速、靈敏、有效的方法來檢測不同品種的抗病性是十分重要的。

近年來，研究人員應用PCR 技術檢測植株組織中的病原菌DNA 來判斷病原菌對植株的侵染特征，該過程操作簡便、特異性強、快速、經濟[7]。目前已建立了針對玉米和高粱的絲黑穗病[8-9]、小麥白粉病和散黑穗病[10-11]、甘蔗黑穗病[12]等的PCR 檢測技術。用PCR 技術檢測特定植物病原菌主要靠引物的有效性，引物設計用到的基因序列有：真菌核糖體脫氧核糖核酸（rDNA）及間隔區，如基因間區（Intergenic spacer，IGS）、核糖體基因內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）等[13-14]；未知的特異DNA 片段；保守的蛋白基因序列。但到目前為止，應用PCR 方法檢測谷子粒黑穗病菌的研究未見報道。

本研究根據黑穗病菌ITS 序列設計PCR 引物，建立了谷子粒黑穗病菌的快速檢測體系，并證明所用引物和PCR 檢測體系在鑒定病菌感染和植株抗病性方面具有較高的特異性，可快速、準確地監測谷子粒黑穗病，并為提前預防谷子粒黑穗病提供特異性高、實用性強的技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

谷子粒黑穗病菌（Ustilago crameri）冬孢子、谷瘟病菌（Pyricularia setariae）菌絲，由山西農業大學谷子研究所郭二虎研究員提供；谷子白發病菌（Sclerospora graminicola）孢子、玉米黑粉菌孢子采自大田發病植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準備 取谷子粒黑穗病菌冬孢子粉過0.297 mm 篩，用于谷種拌菌。選用對黑穗病抗性不同的谷子品種晉谷21 和長農35，設谷種拌菌組與不拌菌對照組，同期播種于山西農業大學谷子研究所試驗田。每個處理播種3 個小區作為重復，每個小區面積30 m2，拌菌組與對照組間設置隔離帶。在谷子拔節期與抽穗期，每小區隨機選3 個樣點，每個樣點隨機選取生長一致的5 株植株，采集拌菌組與對照組植株各5 株，帶回實驗室備用。

1.2.2 病原菌和谷子DNA 的提取 稱取一定量的病原菌孢子粉或谷子葉片/穗梗于研缽中，加少許石英砂，加入CTAB 提取液[15-16]，充分研磨，勻漿液轉入離心管中于65 ℃水浴50 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1（V/V）），10 000 r/min 離心10 min。取上清，加入RNase A，37 ℃水浴40 min。加入等體積的預冷異丙醇，12 000 r/min 離心15 min，沉淀用75%乙醇漂洗，溶于TE。用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA分子的完整性，測OD260和OD280值檢測提取物的濃度和純度。

1.2.3 谷子粒黑穗病菌DNA 的序列分析 以真菌ITS 的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為擴增引物，以谷子粒黑穗病菌DNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后送華大基因有限公司測序，測序結果用Blast 進行分析，并用Clustal X，MEGA 5.0 獲得系統發育樹。

1.2.4 谷子粒黑穗病菌特異性引物設計 將菌株Ustilago avenae（登錄號AY740062.1）、Ustilago hordei（登錄號AY740068.1）、Ustilago maydis （登錄號AY345004.1）、Ustilago nuda（登錄號AY740069.1）的rDNA-ITS 序列與谷子黑穗病菌ITS 序列進行比對，選擇與谷子黑穗病菌ITS 序列相似度高的菌株的ITS 序列，利用生物學軟件Clustal X 進行比對分析，運用軟件Primer Premier 5.0 設計谷子粒黑穗病菌特異性引物，其中，上游引物F1序列為5′-AGAC GGGTTTACCACTCAAC-3′，下游引物R1序列為5′-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3′，由生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.5 引物特異性及靈敏度檢測 分別以谷子黑穗病菌孢子、谷子白發病菌孢子、谷瘟病菌菌絲、玉米黑粉菌孢子及對照組谷子葉片的基因組DNA 作為PCR 擴增模板，用自行設計的谷子粒黑穗病菌ITS 引物進行PCR 擴增。擴增體系為20 μL，包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.4 μL，DNA模板量0.4～1.0 μL，Taq 酶0.2 μL，余量用雙蒸水補足。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將谷子粒黑穗病菌基因組DNA 濃度分別調整為100、10、1 ng/μL、100、10、1、0.1 pg/μL，作為PCR擴增模板，采用上述引物和條件進行PCR 擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 大田谷子植株粒黑穗病菌侵染性檢測 以谷種拌菌組和不拌菌對照組谷子的旗葉和穗梗的基因組DNA 作為PCR 擴增模板，用谷子粒黑穗病菌ITS 引物進行PCR 擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現特異性擴增條帶則說明谷子特定組織被黑穗病菌侵染。

2 結果與分析

2.1 谷子粒黑穗病菌ITS 序列特征分析

將提取的谷子粒黑穗病菌冬孢子DNA 進行ITS-PCR 擴增，擴增產物測序結果在GeneBank 中進行Blast 檢索分析，構建Neighbour Joining 分子發育樹。結果顯示（圖1），粒黑穗病菌孢子ITS 序列長度在700 bp 左右，與GeneBank 數據庫中的谷子粒黑穗病原菌（AY344999.1 Ustilago crameri）的序列同源性為95%，系統發育樹中聚在一支。說明本研究從田間發病谷穗得到的病原菌為谷子粒黑穗病菌。

2.2 引物特異性與靈敏度檢測

用自行設計的谷子粒黑穗病菌引物對不同供試樣品基因組DNA 進行PCR 擴增，擴增產物電泳分析發現，僅谷子粒黑穗病菌基因組DNA 作模板時能擴增出1 條特異性條帶，大小與目標片段（320 bp）基本一致，其他供試菌株及對照組谷子葉片沒有擴增產物。結果表明，所設計的引物對谷子粒黑穗病菌具有特異性（圖2）。

采用相同的擴增體系和擴增程序，測試粒黑穗病菌基因組DNA 模板量對擴增的影響，結果表明（圖3），模板質量濃度為100、10、1 ng/μL 以及100、10 pg/μL時均可獲得清晰的目標條帶，模板量為1、0.1 pg/μL 時，PCR 擴增未能得到目標條帶。因此，本研究建立的PCR 檢測體系在粒黑穗病菌基因組DNA 質量濃度為10 pg/μL 時能夠檢出。

2.3 PCR 檢測大田谷子植株中的病原菌結果

以谷子穗梗和旗葉頂端組織基因組DNA 作模板，用自行設計的谷子粒黑穗病菌引物進行PCR檢測。結果發現，以未拌菌對照組谷子穗梗和旗葉基因組DNA 為模板進行PCR 擴增時，瓊脂糖凝膠電泳未檢出擴增產物；以拌菌發病植株穗梗和旗葉的基因組DNA 為模板，PCR 擴增檢出了谷子粒黑穗病菌的特異性序列（圖4）。

以拌菌未發病植株穗梗和旗葉基因組DNA 為模板，用特異性引物進行PCR 擴增，擴增產物電泳結果表明（圖5），晉谷21 的5 株植株中有1 株的穗梗及旗葉中擴增出特異性條帶，有1 株旗葉中擴增出條帶、穗梗中未擴增出條帶，其余3 株的穗梗和旗葉中均沒有擴增產物；長農35 有4 株的穗梗和旗葉中檢測出特異性條帶，1 株穗梗和旗葉中均沒有檢出擴增產物。結果表明，長農35 拌菌組植株中黑穗病菌檢出率高于晉谷21，該結果與2 個品種的黑穗病發病率[6]相一致。

3 結論與討論

谷子粒黑穗病是一種真菌性病害，黑穗病發生的嚴重程度取決于谷子品種的抗病性和環境條件。本研究根據谷子粒黑穗病菌ITS 序列，設計了1 對引物F1/R1，應用該引物對谷子粒黑穗病菌、白發病菌、谷瘟病菌和玉米黑粉菌基因組DNA 進行PCR擴增，結果表明，只有谷子粒黑穗病菌擴增出1 條特異性條帶，說明這對引物對谷子粒黑穗病菌是特異的，且檢測到的黑穗病菌基因組DNA 的最低質量濃度為10 pg/μL。對谷種拌菌組植株的檢測結果表明，所設計的特異性引物在鑒定植株抗病性方面具有較高的特異性。

朱桂清等[11]用真菌rDNA 非編碼區ITS1 的通用引物設計了特異性引物，對小麥散黑穗病菌進行了PCR 檢測；程穎慧等[17]根據ITS 片段設計引物檢測小麥腥黑穗病菌，并用于與黑麥腥黑粉菌的區分。商蓓等[18]應用真菌rDNA 的ITS 序列設計了對蘋果黑星病菌有高度特異性的引物，可檢測到蘋果黑星病菌基因組DNA 濃度是100 fg/μL；王楠等[19]研究設計的谷子銹病菌IGS 序列特異性引物，利用巢式PCR 建立了對谷子銹病的檢測體系，檢測到病原菌基因組DNA 最低質量濃度為100 pg/μL。本研究建立的PCR 技術體系能夠檢測到的谷子粒黑穗病菌基因組DNA 最低質量濃度為10 pg/μL，具有較高的檢測靈敏度。

用設計的特異引物對谷種拌菌組發病植株進行病原菌檢測，在穗梗和旗葉中都檢出特異性條帶，表明病原菌隨植株的生長發育，對植株頂端的旗葉及穗梗都進行了侵染，病菌對植株的侵染是全身性的。用此引物對拌菌組中未發病植株進行檢測，長農35 穗梗與旗葉中檢出粒黑穗病菌的植株數多于晉谷21，這與田間植株發病率數據[5]基本一致。本研究建立的PCR 體系可對谷子粒黑穗病菌進行定性檢測，對定量檢測還需進一步研究。

綜上所述，本研究初步建立了谷子粒黑穗病菌的PCR 檢測鑒定方法，這種快速、高效的檢測手段為今后谷子粒黑穗病菌的檢測鑒定提供了基礎，并且可以用于檢疫研究、流行病害調查、谷子粒黑穗病過程控制和不同谷子品種抗病性鑒定。