LncRNA H19、P21在上皮性卵巢癌中的表達及其臨床意義①

賴慧超 肖婷婷 劉劍英 黃雪梅 徐敏娟

（贛州市人民醫院婦科，贛州341000）

上皮性卵巢癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤之一，其發病隱匿且進展迅速，惡性程度相對于其他婦科腫瘤較高[1］。目前臨床多采用放化療及手術等手段進行上皮性卵巢癌治療，但由于患者就診時已處于晚期、腫瘤細胞耐藥發生等原因，患者5年生存率仍處于較低水平[2］。尋找新的相關腫瘤生物標志物對準確評估上皮性卵巢癌患者病情進展及患者預后有重要意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一種穩定存在于機體內的調控因子，在腫瘤進展中與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等密切相關。研究表明，LncRNA H19在宮頸癌組織中高表達，可能作為宮頸癌診斷的生物標志物[3］。乳腺癌患者血清中LncRNA H19表達水平也明顯升高，與腫瘤細胞增殖、凋亡調控密切相關[4］。此外，已有研究證實LncRNA P21是腫瘤進展中的抑制因子，可用作腫瘤細胞周期調控[5］。有研究發現，乳腺癌組織中LncRNA H19水平上調，可與p53發生拮抗并靶向促進上皮間充質轉化過程，促進癌細胞的侵襲和轉移[6］。而p53也被證實在頭頸部鱗狀細胞癌中可靶向上調LncRNA P21表達發揮其抑制腫瘤細胞增殖作用[7］。表明腫瘤進展中LncRNA H19與LncRNA P21表達可能存在一定相關性。另由于LncRNA H19與LncRNA P21在上皮性卵巢癌中研究較少，作用機制尚不明確，本研究通過檢測上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、P21表達水平，分析二者間相關性及與患者預后關系，初步探討其在上皮性卵巢癌發生發展中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016年7月至2020年7月本院收治的上皮性卵巢癌患者50例作為研究對象（上皮性卵巢癌組），患者年齡29～76歲，平均（53.08±10.32）歲。納入標準：①根據國際婦產科聯合會（International federation of gynecology and obstet‐rics，FIGO）分期標準[8］、世界衛生組織（World health organization，WHO）分級標準[9］，經病理切片證實為上皮性卵巢癌；②均需進行手術治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并患有其他部位惡性腫瘤患者；②心、腎、肝臟等功能嚴重不足者；③患有嚴重精神疾病者；④使用過藥物治療或放療及化療者。另選取同期在本院進行手術治療的上皮性卵巢良性腫瘤患者50例作為良性腫瘤組，包括漿液性囊腺瘤34例、黏液性囊腺瘤16例。良性腫瘤組患者年齡28～74歲，平均（52.84±10.18）歲。上皮性卵巢癌組與良性腫瘤組患者年齡比較差異無統計學意義（P>0.05）。另選擇于本院進行健康體檢的正常女性50例為對照組。本研究經本院倫理委員會批準同意。1.1.2主要儀器與試劑 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號：7500）購自美國ABI公司；RNA提取試劑盒（貨號：775001）、反轉錄試劑盒（貨號：866001）、qRT-PCR試劑盒（貨號：3914001）購自美國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對象均于入院時抽取空腹靜脈血10 ml，室溫以3000 r/min離心10 min獲取血漿樣本，并在?80℃冰箱保存待檢。

1.2.2 血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達水平檢測 采用qRT-PCR法檢測血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達水平。使用試劑盒進行RNA提取及RNA反轉錄，所得cDNA在相應反應體系下進行qRT-PCR實驗。20 μl反應體系如下：SYBR?Primix Ex TaqTM10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各2 μl，無 酶水3.6 μl。反應 步驟 如下：95℃8 min，1個循環；95℃15 s，62℃38 s，73℃15 s，40個循環，每個樣品設3次重復。實驗以GAPDH為內參基因，LncRNA H19上游引物：5'-TGATGACGGGTG‐GAGGGGCTA-3'，下 游 引 物：5'-TGATGTCGCCCT‐GTCTGCACG-3'；LncRNA P21上游引物：5'-GGGTG‐GCTCACTCTTCTGGC-3'，下游引物：5'-TGGCCTT‐GCCCGGGCTTGTC-3'；GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。采用2???Ct法計算血漿Lnc-RNA H19、LncRNA P21相對表達水平。

1.3 統計學分析 使用SPSS23.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料用[n（%）］表示，行χ2檢驗。計量資料以±s表示，兩組數據比較行t檢驗；多組數據比較采用單因素方差分析，總體有差異再行SNK-q檢驗進行兩兩比較。采用Pearson法分析上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平相關性；采用Logistic回歸模型進行危險因素分析，采用向后剔除法，行LR檢驗；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平對上皮性卵巢癌發生的診斷價值。P<0.05表示數據之間差異有統計學意義。

2.2 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達水平與患者臨床病理特征關系 不同年齡、腫瘤直徑、病理類型、病理分級及是否更年期患者上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移患者血漿LncRNA H19表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者，血漿LncRNA P21表達水平低于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者（P<0.05），見表2。

表2 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達水平Tab.2 Plasma LncRNA H19 and LncRNA P21 expression levels in patients with epithelial ovarian cancer

2 結果

2.1 三組血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達水平比較 如表1所示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA H19表達水平明顯高于上皮性卵巢良性腫瘤組和對照組（P<0.05），血漿LncRNA P21表達水平明顯低于上皮性卵巢良性腫瘤組和對照組（P<0.05）。

表1 3組血漿LncRNA H19、P21表達水平比較（±s）Tab.1 Comparison of plasma LncRNA H19 and P21 expression levels in 3 groups（±s）

表1 3組血漿LncRNA H19、P21表達水平比較（±s）Tab.1 Comparison of plasma LncRNA H19 and P21 expression levels in 3 groups（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with benign tumor group，2）P<0.05.

Groups Epithelial ovarian cancer Benign tumor Control F P n 505050? ?LncRNA H192.95±0.721）2）1.18±0.301.01±0.28252.0890.000 LncRNA P210.46±0.181）2）0.94±0.291.03±0.3166.2510.000

2.3 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與Ln‐cRNA P21表達水平相關性 如圖1所示，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平呈負相關（r=?0.429，P=0.000）。

圖1 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平相關性Fig.1 Correlation between plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 in patients with epithelial ovarian cancer

2.4 上皮性卵巢癌發生的影響因素分析 單因素分析結果顯示，FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、Lnc-RNA H19高表達、LncRNA P21低表達是影響上皮性卵巢癌發生的危險因素（P<0.05）。多因素分析結果顯示，FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、Lnc-RNA H19高表達、LncRNA P21低表達是影響上皮性卵巢癌發生的獨立危險因素（P<0.05），見表3、4。

表3 影響上皮性卵巢癌發生的單因素Logistic回歸分析Tab.3 Univariate Logistic regression analysis of epithelial ovarian cancer

表4 影響上皮性卵巢癌發生的多因素Logistic回歸分析Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors on occurrence of epithelial ovarian cancer

2.5 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平對上皮性卵巢癌發生的診斷價值分析 如圖2和表5所示，血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達水平聯合對上皮性卵巢癌發生診斷的曲線下面積為0.892，均明顯高于二者單獨對上皮性卵巢癌發生診斷的曲線下面積（0.804、0.797，Z=2.134、2.122，P=0.033、0.034）。

圖2 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平對上皮性卵巢癌發生的診斷價值Fig.2 Diagnostic value of plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 expression levels in epithelial ovarian cancer

表5 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平對上皮性卵巢癌發生的診斷價值分析Tab.5 Diagnostic value of plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 expression levels in epithelial ovarian cancer

3 討論

卵巢癌作為婦科三大惡性腫瘤之一，仍是威脅女性生命健康的主要惡性疾病，其中上皮性卵巢癌約占全部卵巢癌的85%以上[10］。目前上皮性卵巢癌進展的病理機制尚未完全明確，在分子水平上探究其發生發展影響因素是提高患者生存率、探尋治療靶點的重要手段。

LncRNA是一類長度大于200 nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質潛能，但可參與機體生長發育、細胞增殖凋亡等多種生物學進程調控，與腫瘤的發生發展密切相關。LncRNA H19位于人類染色體11p15.5，是第一個被發現的印記基因，已被證實對腫瘤發生具有抑制和促進雙重作用[11］。研究表明，前列腺癌細胞系中過表達LncRNA H19可靶向miR‐NA抑制癌細胞遷移[12］。此外有研究發現，體外過表達LncRNA H19可促進卵巢癌細胞對順鉑耐藥，并可通過調節上皮間充質轉化過程促進癌細胞增殖遷移[13］。本研究結果顯示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA H19表達水平明顯高于上皮性卵巢良性腫瘤組和對照組，與WU等[13］的研究結果相似，提示血漿LncRNA H19表達水平升高可能與上皮性卵巢癌發生有關。進一步研究發現，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移患者血漿LncRNA H19表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者，提示LncRNA H19可能通過調節癌細胞增殖、遷移促進上皮性卵巢癌發展。而已有研究表明LncRNA H19在非小細胞肺癌中表達顯著上調，與靶向p53調控癌細胞增殖有關[14］，推測本研究中LncRNA H19可能靶向調控p53基因水平影響上皮性卵巢癌細胞增殖等。

LncRNA P21位于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（cyclin-dependent kinase inhibitor 1，P21）上游約15 kb處，與細胞增殖、凋亡調控密切相關。P21被證實在膀胱癌、肺癌、結直腸癌中表達水平降低，與腫瘤細胞增殖、遷移等受到抑制有關[15-17］。本研究結果顯示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA P21表達水平明顯低于上皮性卵巢良性腫瘤組和對照組，且Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移患者血漿LncRNA P21表達水平較Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者低，與前人在其他腫瘤中研究結果相似[15-17］，提示LncRNA P21表達水平下調可能與上皮性卵巢癌的發生有關，其水平持續降低可能預示患者病情進一步發展。可能調控機制為，LncRNA P21水平下調時其與STAT3等結合減少，進而導致其對細胞周期G1期阻滯和誘導細胞凋亡能力減弱，最終促進腫瘤進展[7］。有研究證實，LncRNA P21是抑癌基因P53的下游調控因子，推測LncRNA P21在上皮性卵巢癌中表達降低可能與p53合成受抑制有關，該機制最終可能通過影響腫瘤上皮間充質轉化抑制卵巢腫瘤生長[18］。

由于LncRNA H19、P21表達均與p53基因表達關系密切[12］，本研究經相關性分析發現，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達水平呈負相關，提示上皮性卵巢癌發生發展中Ln‐cRNA H19、LncRNA P21間可能存在共同的調控通路，以發揮其調控癌細胞增殖遷移作用。進一步研究發現，血漿LncRNA H19高表達、血漿LncRNA P21低表達是影響上皮性卵巢癌發生的危險因素，且二者聯合對上皮性卵巢癌的診斷效能較高，提示血漿LncRNA H19、P21表達水平與上皮性卵巢癌進展密切相關，可能用于評估上皮性卵巢癌發生。

綜上所述，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19呈高表達、血漿LncRNA P21呈低表達，均與腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移密切相關，二者聯合對上皮性卵巢癌發生的診斷價值較高。但由于本研究僅從表達水平層面分析二者間相關性，具體的作用機制及診斷價值尚需進一步進行驗證。